防御素基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

论文摘要

本文主要根据GenBank已公布的兔防御素NP-1基因和猪防御素pBD-1基因序列,分别选用原核或真核高效表达载体构建重组表达质粒,以期在大肠杆菌或COS-7细胞中得到高效表达,为进一步研究这两个抗菌肽奠定基础。 在实验一中,根据兔防御素NP-1基因序列,选用大肠杆菌偏爱的密码子,应用计算机辅助设计,去除基因原有的影响其在大肠杆菌中高效表达的成分,对原有的NP-1基因序列进行改造,经改造后的NP-1基因其编码的氨基酸多肽链一级结构保持不变。将改造后的NP-1基因分为两段进行人工合成,这两个片段为互补链,各含59bp,中间有13bp的碱基重叠互补。采用PCR技术将两个片段延伸成一条完整的NP-1基因链。为了让NP-1基因能正确有效地连接到表达载体pMAL-p2X上,我们设计了分别带有Xba Ⅰ、HindⅢ酶切位点的扩增该基因的上下游引物。将该基因扩增得到的带酶切位点的产物克隆到pGEM-T easy Vector上,经酶切鉴定和序列分析正确后,再经双酶切连接到用同样酶切的载体pMAL-p2X上,并将得到的重组表达载体转化大肠杆菌E. coli TB1,以浓度为0.1mM的IPTG诱导表达。诱导产物经12%的聚丙烯酸胺凝胶电泳进行检测,结果显示有分子量约为4.0KD的特异蛋白质条带出现,说明兔NP-1基因在大肠杆菌中得到成功表达。 在实验二中,根据猪防御素pBD-1基因序列,应用计算机软件设计出一对带有酶切位点Hind Ⅲ,Xba Ⅰ的引物。从新鲜的猪舌表皮组织细胞中分离提取总RNA,经逆转录PCR（RT-PCR）扩增出猪防御素pBD-1基因的第一链cDNA,将回收的第一链cDNA产物用上述特异引物再次扩增、回收,得到约213bp的目的片段,用T4DNA连接酶将其克隆到pGEM-T easy Vector上,然后双酶切克隆质粒,再将回收的目的条带连接到同样经双酶切回收后的真核表达质粒pcDNA3.1（+）上。经酶切鉴定和序列分析,猪防御素pBD-1基因成功连接到表达载体上。序列分析结果同时显示,在猪pBD-1基因扩增产物中编码成熟肽部分的一个碱基与发表的pBD-1 cDNA序列不同,即第104位碱基由A变为G,导致该处编码的氨基酸由赖氨酸变为精氨酸。该碱基的变异可能与猪品种不同有关。本实验猪防御素pBD-1基因表达载体的成功构建,为进一步研究pBD-1基因表达产物的抗菌活性及其抗菌机理打下了基础。

论文目录

• 摘要
• 英文摘要
• 第一部分 文献综述:抗菌肽的研究进展
• 1. 抗菌肽的发现与分类
• 1.1 抗菌肽的发现
• 1.2 抗菌肽的分类
• 2. 抗菌肽的基因结构特点
• 3. 抗菌肽的结构特点及其抗菌机理
• 3.1 抗菌肽的结构特点
• 3.2 抗菌肽的抗菌机理
• 4. 抗菌肽基因的重组表达和转基因研究
• 4.1 抗菌肽基因的重组表达
• 4.2 抗菌肽基因的转基因研究
• 5. 抗菌肽的研究展望
• 第二部分 实验内容
• 实验一、兔防御素 NP-1基因表达载体构建及其表达
• 1. 材料
• 1.1 载体和菌株
• 1.2 试剂
• 1.3 实验所用溶液及其配制
• 1.4 主要仪器设备
• 2. 方法
• 2.1 兔防御素基因 NP-1的克隆
• 2.2 原核重组表达载体的构建和鉴定
• 3. 结果与分析
• 3.1 猪防御素pBD-1基因的克隆
• 3.2 NP-1基因表达载体构建
• 3.3 NP-1基因在大肠杆菌的表达
• 4. 讨论
• 5. 结论
• 实验二、猪防御素pBD-1基因真核表达载体构建
• 1. 材料
• 1.1 载体和菌株
• 1.2 试剂
• 1.3 实验所用溶液及其配制
• 1.4 主要仪器设备
• 2. 方法
• 2.1 猪防御素pBD-1基因的克隆
• 2.2 真核重组表达载体的构建和鉴定
• 3. 结果与分析
• 3.1 猪防御素pBD-1基因的克隆
• 3.2 猪防御素pBD-1基因表达载体鉴定
• 4. 讨论
• 5. 结论
• 附图
• 参考文献
• 致谢