EB病毒LMP1通过p53调控survivin的分子机制研究

论文摘要

肿瘤的形成是细胞调节通路及其网络整体紊乱的结果。与正常细胞相比,往往一些通路处于异常激活状态,而有些通路却传递受阻。因此,在肿瘤中,增殖失控、凋亡受阻及侵袭与转移等都是常见的信号转导异常的结果。EB病毒是第一个发现与人类肿瘤相关的DNA致瘤病毒。EB病毒的感染与人类的Burkitt’s淋巴瘤、何杰金氏病、鼻咽癌、肺癌、胃癌和乳腺癌等多种肿瘤的发生相关,鼻咽癌与EB病毒的关系最为密切。其中EB病毒编码的潜伏膜蛋白LMP1是重要的致瘤蛋白,以鼻咽癌为切入点,我们多年的研究工作一直致力于LMP1介导的信号转导通路的研究。LMP1通过NF-κB、AP-1、JAK/STAT信号转导通路及其之间的cross-talk作用于下游众多的调节基因,其中包括抗凋亡基因survivin和细胞周期表达相关基因p53从而参与细胞增殖、转化、凋亡等多种生物学功能。Survivin是1997年发现的凋亡抑制蛋白IAPs（Inhibitor ofApoptosis Protein）家族的新成员,与其他IAP家族成员不同的是,它在正常分化的成人组织中很少表达,但在胚胎和发育的胎儿组织以及大多数的肿瘤组织和转化细胞中高度表达。Survivin分子结构中的BIR（Baculovirus IAP Repeat）与其抑制凋亡的功能密切相关。Survivin在肿瘤细胞中的表达具有严格的细胞周期依赖性,在G2/M期特异性表达,它具有调控细胞周期和抑制细胞凋亡的双重作用。Survivin的结构中含有一个CDC2/CyclinB1特异性的磷酸化位点,它位于survivinThr34,这个磷酸化位点对于survivin与多聚微管/有丝分裂纺锤体的相关性,以及在有丝分裂期survivin抑制caspase-9的活性是必需的。同时,survivin也可通过移位于核与CDK4结合促进G1/S期的转换。从而提示,survivin不仅对G2/M期具有调控功能,同时,在对G1/S期的调控中也具有重要的生物学意义。Survivin抑制细胞凋亡的机制是非常复杂的,它可以通过调节基因的表达,通过蛋白质之间的相互作用以及线粒体的动力学等多种方式实现。我们的工作证实LMP1能够通过活化NF-κB和AP-1介导抗凋亡蛋白survivin的异常激活。LMP1表达介导survivin核移位,促进细胞Rb磷酸化增加,导致S期演进,促进细胞周期行进,从而促进细胞增殖;LMP1能够同时促进survivin和CDK4的表达以及二者移位于核,并且能够介导两者的结合,这对于G1/S期的演进具有重要作用。LMP1通过survivin介导细胞凋亡的抑制。Survivin反义核酸可抑制survivin表达,抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡。这些研究结果为我们进一步探讨EBV-LMP1介导survivin促进细胞增殖和抑制细胞凋亡的分子机制提供了有意义的实验依据。研究发现,许多肿瘤中都存在有survivin的过度表达和野生型p53的缺失或突变。p53基因的突变可能通过细胞内一条或多条信号通路刺激survivin的表达。野生型p53（wt-p53）可以在转录水平抑制survivin表达。在survivin启动子上有p53结合位点。p53可以直接结合到survivin的启动子上,还可通过与其他蛋白,如E2F,sin3和HDAC等形成复合物结合到survivin启动子上从而抑制survivin的表达。p53还可以直接结合到cdc2/cyclinB1的催化亚基上,通过抑制cdc2/cyclinB1激酶的活性,使细胞内survivin的磷酸化水平下调。同时,survivin也可通过caspase/Mdm2以及AuroraB对p53在蛋白水平上进行调控。p53基因作为重要的抑癌基因,人类肿瘤中约50%以上与p53基因变化有关。p53是一种核内磷酸化蛋白,是细胞生长周期中负调节因子,与细胞周期的调控、DNA修复、细胞分化、细胞凋亡等重要的生物学功能有关。但与其他肿瘤不同的是,鼻咽癌中p53基因的突变频率很低（＜10%）,且出现了p53蛋白积聚的现象。许多研究表明p53在鼻咽癌的发生发展过程中是具有活性的。我们的前期研究发现,永生化鼻咽上皮NP69细胞模型中存在大量游离的野生型的p53,并且其中p53是具有活性的,LMP1能在转录水平和蛋白水平调节p53的表达。我们发现LMP1可通过MAPK（Mitosis active protein kinase）信号转导通路调节p53多个位点的磷酸化,并促进p53的转录活性、反式激活能力以及降低p53与MDM2的结合能力,从而促进LMP1对p53活性和稳定性的调节。同时,我们在其他鼻咽癌细胞模型中的研究工作也证实LMP1可通过活化核转录因子NF-κB和AP-1上调p53蛋白的表达及其反式激活活性,降低cdc2/cyclinB1复合物的激酶活性,诱导细胞阻滞于G2/M期,但未有凋亡的发生。因此,我们假设,在鼻咽癌细胞中,LMP1有可能通过调控p53的转录活性,进而调控survivin。我们在p53外显子8突变的的鼻咽癌细胞系（CNE1,CNE1-LMP1）和含野生型p53的永生化鼻咽细胞系（NP69,NP69-pLNSX,NP69-LMP1）中,通过Western blotting技术结合阻断策略检测细胞中p53基因沉默前后survivin的蛋白水平变化。结果发现,无论是在p53外显子8突变的鼻咽癌细胞模型还是在含野生型p53的鼻咽细胞模型中,LMP1均可上调p53和survivin的蛋白水平及其活性;在LMP1调控下,转染p53siRNA质粒后,survivin的蛋白水平也呈明显下调。这些结果证实了我们的假设,即LMP1可以通过转录因子p53上调survivin。结合上述研究进展及我们的工作基础,我们认为LMP1通过p53上调survivin与p53外显子8突变无关。进一步,我们对LMP1通过转录因子p53调控survivin的分子机制进行探讨。转录水平上,我们从p53对survivin基因反式调控以及p53和survivin基因DNA结合能力两方面,主要采用报告基因分析、电泳凝胶迁移率改变（EMSA）等分子生物学实验方法结合阻断策略,探讨在LMP1调控下,p53对survivin基因的调控。报告基因结果显示,LMP1可以明显上调survivin基因的启动子活性,但在阻断p53基因表达之后,survivin基因的启动子活性明显下降,这提示LMP1可以通过p53上调survivin基因启动子的活性。EMSA结果也显示,LMP1可以促进p53和survivin基因DNA的结合能力,但在阻断p53基因表达之后,二者结合能力明显下降。同时,我们还从p53和survivin的细胞定位以及二者在蛋白水平的结合能力,采用免疫荧光,胞浆胞核Western blot分析和免疫共沉淀的方法,探讨LMP1调控下,p53对survivin在蛋白水平的调控。免疫荧光和胞浆胞核Western blot结果表明,LMP1可以促进p53和survivin的核移位;免疫共沉淀结果表明,p53和survivin可以在蛋白水平相互作用,但在LMP1阴性和阳性的细胞中无明显差异。上述结果提示我们,LMP1通过p53上调survivin可能主要发生在转录水平。此外,我们还通过流式细胞技术对LMP1通过p53上调survivin对细胞凋亡的作用进行了初步探讨。我们发现,阻断p53基因表达后,细胞的凋亡率增加,这是因为survivin的表达下调,其抑制凋亡功能也降低所致。从而更进一步证实了p53在鼻咽癌细胞中的功能主要不是发挥促进凋亡的作用。本课题首次发现了在鼻咽癌细胞中LMP1可以通过p53上调survivin,即LMP1可以通过核转录因子p53上调survivin基因的启动子活性,促进p53蛋白和survivin启动子DNA的结合能力,进而上调survivin的蛋白水平,发挥其在鼻咽癌细胞中促进细胞增殖和抑制细胞凋亡的功能。这不仅为我们全面理解LMP1的致瘤功能,并且为进一步阐明p53在鼻咽癌中的功能提供了新的理论和实验依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 英文缩写注解
• 前言
• 材料与方法
• 1.实验材料
• 2.主要实验方法
• 结果
• 1.明确EBV-LMP1对p53和survivin的调控
• 2.确定EBV-LMP1通过p53调控survivin
• 3.确定LMP1调控下,p53对survivin基因启动子活性的影响
• 4.确定LMP1调控下,p53与survivin基因启动子的结合能力
• 5.确定LMP1调控下,p53和survivin的细胞定位
• 6.确定LMP1调控下,p53和survivin在蛋白水平的结合
• 7.确定LMP1通过p53调控survivin对细胞凋亡的作用
• 分析与讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 致谢
• 攻读学位期间主要研究成果