苏云金芽胞杆菌菌株CT-43中苏云金素合成基因簇thuABCDEFG的克隆与合成途径分析

论文摘要

苏云金素（thuringiensin）,本文将其简称为Thu,是由某些苏云金芽胞杆菌产生的小分子量核苷类杀虫活性物质,化学式C22H32O19N5P。对直翅目、等翅目、鳞翅目、半翅目、膜翅目和双翅目等6种昆虫、数种螨类和线虫具有毒杀作用。目前国内外研究居多的是苏云金素的分离与纯化方面,对于其分子水平的研究则较少,关于苏云金素是如何合成或调控的等方面依然是未知。本研究以苏云金素高产菌株苏云金芽胞杆菌CT-43为出发菌株,通过质粒消除和Southern杂交实验初步将苏云金素合成相关基因定位于一个含有cry1B基因的大质粒pBMB0558上。通过构建菌株CT-43的全基因组细菌人工染色体（BAC）文库,克隆并测序了质粒pBMB0558。该质粒全长109,464 bp,序列分析发现pBMB0558含有一个与抗生素合成类似的NRPS＼PKS基因簇,该基因簇依赖于一个酰基载体蛋白（ACP）并具有部分非核糖体肽合成酶基因。在此基因簇旁边还有一个类Ⅳ型分泌途径,含有VirB4,VirB11及VirD4等蛋白编码基因。此外pBMB0558上还含有一个原噬菌体（prophage）和一些与结合转移及转座相关的基因。通过构建一个可以装载大片段的穿梭载体pEMB0557,菌株CT-43的全基因组苏云金芽胞杆菌BAC文库构建完成并进行了苏云金素表达子的筛选。高效液相色谱（HPLC）筛选出一个可以异源产生苏云金素的BAC克隆子,对此BAC克隆子进行功能域的缩小实验,将苏云金素合成基因簇定位在12 kb片段上,并命名此簇为thuABCDEFG,序列分析显示该片段来自于质粒pBMB0558。对thuABCDEFG进行进一步的生物信息学分析,推导出了苏云金素的合成途径,共分为两个部分:阿洛糖二酸（allose diacid）的合成与苏云金素前体物腺苷葡萄糖阿洛糖二酸（adenosine glucose allose diacid）的组装。阿洛糖二酸的合成前体物可能来源于常规代谢途径中的6-磷酸葡萄糖,而组装过程类似于非核糖体肽/聚酮合成途径的杂合途径,但与已经报道的杂合途径又有差别。该途径可以分为三个功能模块,模块一负责阿洛糖二酸的识别与悬挂;模块二负责糖苷的转移;模块三进行腺苷的识别与连接。其中模块一又可以分为三个功能区域,区域一是酰基载体蛋白来自于聚酮合成途径（PKS）,但另外两个区域腺苷酰化区域（A）和缩合区域（C）则来自于非核糖体肽途径（NRPS）,所以命名为NRPS/PKS-like途径。基因簇旁边的甲基转移酶（methyltransferase）推测与合成后修饰相关。为了验证此途径,本研究还开展了基因簇thuABCDEFG中的一个在3′-C原子上添加磷酸基团的特殊酶基因thuE的基因中断实验。中断后的突变株BMB0545和野生株CT-43的上清液和胞内代谢物分别进行了LC-micrOTOF和LCMS-IT-TOF飞行质谱实验,质谱结果显示thuE基因中断后,上清液中没有了苏云金素的700的m/z值,胞内代谢物的m/z值证明了6-磷酸葡萄糖（6-P-glucose,m/z:259）、6-磷酸葡萄糖酸（6-P-glucoseacid,m/z:275）、阿洛糖酸（allose acid,m/z:195）、阿洛糖二酸（allose diacid,m/z:209）、腺苷（adenosine,m/z:266）、葡萄糖阿洛糖二酸（m/z:354）、腺苷葡萄糖阿洛糖二酸（adenosine glucose allose diacid,m/z:603）等前体物的存在,而且在突变株BMB0545胞内m/z值为603的腺苷葡萄糖阿洛糖二酸发生了积累,部分验证了该途径的可行性。在野生株CT-43的胞内没有m/z值为700的苏云金素的存在,证明磷酸基团是在合成途径中最后一步加到前体物腺苷葡萄糖阿洛糖二酸上,且可能是在跨膜的过程中添加,保证了细胞内不存在完整的苏云金素分子,从而可以保护细胞不会受到苏云金素的毒害。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 1 前言
• 1.1 苏云金素概况
• 1.1.1 苏云金芽胞杆菌简介
• 1.1.2 苏云金素的特性与结构
• 1.1.3 苏云金素的杀虫机理
• 1.1.4 苏云金素的分离与纯化
• 1.1.5 苏云金素的安全性鉴定
• 1.1.6 苏云金素合成基因的研究现状
• 1.1.6.1 苏云金素的发现
• 1.1.6.2 苏云金素的合成与质粒间的关系
• 1.1.6.3 苏云金素的合成及分泌途径的研究
• 1.1.6.4 苏云金素蛋白质组水平的研究
• 1.2 抗生素的合成途径
• 1.2.1 抗生素的分类
• 1.2.2 抗生素的作用方式
• 1.2.3 抗生素的合成方式
• 1.2.3.1 非核糖体肽合成途径
• 1.2.3.2 聚酮合成途径
• 1.2.3.3 聚酮合成酶-非核糖体肽合成酶杂合合成途径
• 1.3 细菌素
• 1.3.1 细菌素的定义
• 1.3.2 细菌素的分类
• 1.3.3 细菌素的生物合成途径
• 1.3.4 细菌素的转录后修饰、激活和运输
• 1.3.5 细菌素生物合成的调控
• 1.3.6 细菌素操纵子的免疫性
• 1.3.7 细菌素与抗生素的区别
• 1.4 苏云金芽胞杆菌菌株CT-43简介
• 1.5 本课题的研究意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株、质粒
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 试剂和仪器
• 2.1.3.1 试剂
• 2.1.3.2 仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 DNA常规操作
• 2.2.1.1 苏云金芽胞杆菌质粒的制备
• 2.2.1.2 大肠杆菌质粒DNA的提取
• 2.2.1.3 DNA的体外重组操作
• 2.2.1.4 大肠杆菌的常规转化
• 2.2.1.5 苏云金芽胞杆菌的电转化
• 2.2.1.6 大肠杆菌转化子的筛选
• 2.2.1.7 苏云金芽胞杆菌重组菌的筛选
• 2.2.1.8 PCR扩增
• 2.2.2 穿梭载体pEMB0557的构建
• 2.2.2.1 复制子ori60和红霉素基因的克隆
• 2.2.2.2 多余酶切位点的定点突变
• 2.2.2.3 重组质粒pEMB0557的构建
• 2.2.3 菌株CT-43基因组大肠杆菌人工染色体文库（BAC文库）的构建
• 2.2.3.1 基因组DNA片段的制备
• 2.2.3.2 细菌人工染色体载体的制备
• 2.2.3.3 大肠杆菌DH10B电转化感受态细胞的制备
• 2.2.3.4 连接与转化
• 2.2.3.5 文库的筛选与保存
• 2.2.4 菌株CT-43质粒BAC文库的构建
• 2.2.5 菌株CT-43基因组苏云金芽胞杆菌BAC文库的构建
• 2.2.6 Southern杂交
• 2.2.7 含有cry1B基因的苏云金芽胞杆菌大质粒pBMB0558的克隆
• 2.2.7.1 含有cry1B基因的BAC克隆子的筛选
• 2.2.7.2 大质粒pBMB0558重叠连锁群图谱的绘制
• 2.2.7.3 可以覆盖整个pBMB0558质粒的BAC克隆子的亚克隆文库的构建
• 2.2.7.4 亚克隆文库的测序及序列拼接
• 2.2.8 苏云金素合成基因簇thuABCDEFG的异源表达
• 2.2.9 苏云金芽胞杆菌CT-43菌株基因中断突变株的筛选
• 2.2.10 苏云金素的分离纯化
• 2.2.10.1 有机溶剂萃取法（用于高效液相色谱-HPLC检测）
• 2.2.10.2 直接过滤法
• 2.2.10.3 胞内物质的提取
• 2.2.11 苏云金素和胞内代谢物的检测
• 2.2.11.1 苏云金素的高效液相色谱检测
• 2.2.11.2 苏云金素和胞内代谢物的飞行质谱检测
• 2.2.12 序列测定和序列分析
• 3 结果与分析
• 3.1 苏云金素合成基因所在的大质粒的定位
• 3.1.1 苏云金芽胞杆菌菌株CT-43质粒消除突变株的筛选
• 3.1.2 苏云金芽胞杆菌菌株CT-43及其突变株与cry1B基因之间的关系
• 3.1.3 cry1B基因所在的大质粒的定位
• 3.2 含有cry1B基因的大质粒pBMB0558的克隆
• 3.2.1 穿梭载体pEMB0557的构建
• 3.2.2 苏云金芽胞杆菌菌株CT-43大肠杆菌BAC文库的构建
• 3.2.2.1 菌株CT-43基因组穿梭BAC文库的构建
• 3.2.2.2 菌株CT-43质粒穿梭BAC文库的构建
• 3.2.3 含有cry1B基因的大质粒pBMB0558重叠连锁群图谱的绘制
• 3.2.3.1 含有cry1B基因的BAC克隆子的筛选
• 3.2.3.2 大质粒pBMB0558重叠连锁群图谱的绘制
• 3.2.4 质粒pBMB0558的序列测定
• 3.2.4.1 能够覆盖质粒pBMB0558的BAC克隆子的亚克隆文库的构建
• 3.2.4.2 质粒pBMB0558序列的拼接
• 3.2.4.3 质粒pBMB0558的序列分析
• 3.3 菌株CT-43苏云金芽胞杆菌BAC文库
• 3.4 苏云金素表达子的筛选
• 3.4.1 大肠杆菌BAC文库的HPLC筛选
• 3.4.2 苏云金芽胞杆菌BAC文库的HPLC-MS筛选
• 3.4.3 功能域的缩短
• 3.5 苏云金素合成基因簇thuABCDEFG的生物信息学分析
• 3.6 苏云金素合成途径的推导
• 3.7 苏云金素合成途径的初步验证
• 3.7.1 基因簇中的thuE基因的中断实验
• 3.7.1.1 中断载体的构建
• 3.7.1.2 thuE基因中断突变株的筛选
• 3.7.2 thuE基因中断突变株的飞行质谱（TOF-MS）检测
• 3.7.2.1 thuE基因中断突变株的胞外检测
• 3.7.2.2 thuE基因中断突变株的胞内检测
• 3.7.3 苏云金素生物合成途径的验证
• 4 讨论
• 4.1 与苏云金素合成相关的基因
• 4.1.1 thuA基因
• 4.1.2 与组装相关的蛋白
• 4.1.3 苏云金素的产量调控因子
• 4.1.4 苏云金素的分泌
• 4.1.5 苏云金素的免疫机制
• 4.2 苏云金素合成基因簇所在大质粒的功能分析
• 5 总结和创新点
• 参考文献
• 致谢
• 附录 已发表和待发表论文及专利