落新妇甙对大鼠肺移植排斥反应抑制作用的实验研究

论文摘要

第一部分大鼠同种异体原位肺移植模型的建立目的:通过大鼠套管法吻合技术建立大鼠左侧原位肺移植模型。方法:将60只SPF级SD大鼠随机分为供、受体两组,采用三套管吻合技术完成大鼠肺移植模型。结果:30例手术中,供肺灌注到摘取时间（10±1）分钟,供肺完成套管时间（10±4）分钟,供体动静脉、支气管吻合时间（15±2）分钟,移植肺热缺血时间（16±2）分钟,冷缺血时间（30±5）分钟,手术平均时间（80±10）分钟,术后15天生存率达86%,其中两例死于急性肺水肿,一例死于肺静脉栓塞,一例死于对侧气胸。结论:三套管大鼠同种异体肺移植模有效、可靠,为临床肺移植提供了较好的实验基础,但是模型操作复杂,需要长时间的学习和反复操作来提高肺移植模型的稳定性。第二部分落新妇甙对大鼠肺移植排斥反应的抑制作用目的:运用排斥反应分级及观察落新妇甙对大鼠移植肺中支气管肺泡灌洗液诱导肺成纤维细胞胶原增生的抑制作用实验,探讨落新妇甙对大鼠肺移植排斥反应的抑制作用。方法:采用大鼠左侧原位肺移植模型。随机将肺移植后的60只大鼠分为4组:A组肺移植后用生理盐水（1ml/天）灌胃,B组肺移植后用环孢素A （5mg/kg/天）灌胃,C组肺移植后用落新妇甙（1mg/kg/天）灌胃,D组肺移植后用环孢素A （2.5mg/kg/天）及落新妇甙（1mg/kg/天）灌胃。术后第30天（每组抽取5只大鼠）切取移植肺观察肺急性排斥反应分级情况;另外每组10只大鼠,取受体支气管肺泡灌洗液。用收集的支气管肺泡灌洗液在体外刺激人胚胎成纤维细胞,通过MTT比色法和酶联免疫（ELISA）法分别检测人胚肺成纤维细胞的增殖及Ⅰ型胶原的合成,并对检测结果进行分析。结果:（1）B组、C组及D组移植肺排斥反应分级均低于A组（P<0.01）;D组移植肺急性排斥反应最轻,优于C组（P<0.05）和B组（P<0.01）。（2）受者移植肺中支气管肺泡灌洗液显著促进了人胚肺成纤维细胞的增殖和胶原合成;（3）B、C、D组的支气管肺泡灌洗液诱导的人胚肺成纤维细胞Ⅰ型胶原合成有显著的抑制作用（P<0.05）。结论:落新妇甙可抑制大鼠移植肺中支气管肺泡灌洗液诱导的人胚肺成纤维细胞的增殖及胶原合成,对大鼠肺移植后的闭塞性细支气管炎具有抑制作用;对肺移植排斥反应有较强的抑制作用,并与环孢素A具有协同作用。第三部分落新妇甙对大鼠肺移植急性排斥反应抑制作用的机制研究实验一落新妇甙对肺移植大鼠活化T细胞的动态影响目的:观察落新妇甙对大鼠移植肺活化T细胞的影响及动态变化,探讨落新妇甙对大鼠移植肺活化T细胞的作用。方法:采用大鼠左侧单肺原位移植模型。大鼠10只不做移植,抽取外周血作为空白对照;随机将肺移植后的40只大鼠分为2组:A组肺移植后用生理盐水（1ml/天）灌胃,B组肺移植后落新妇甙（1mg/kg/天）灌胃。移植前（空白对照）、术后第2天、术后第5天,分别用荧光标记抗体双染色结合流式细胞技术检测各阶段大鼠T细胞表达的活化抗原CD69、CD25和CD71的表达。结果:术后第2天,各组检测的CD69、CD25和CD71抗原均显著高于对照组（P<0.01）,且B组和A组有统计学差异（P<0.05）,显示术后第2天,活化T细胞增加,但落新妇甙能显著抑制T细胞的活化。术后第5天,B组CD69、CD25和CD71抗原基本降至正常水平,显著低于A组。结论:落新妇甙能显著抑制急性排斥反应诱导的T细胞活化,对肺移植排斥反应有较强的抑制作用。实验二落新妇甙诱导移植肺活化T细胞凋亡减轻急性排斥反应目的:探讨落新妇甙对大鼠肺移植后机体急性排斥反应的影响和机制。方法:建立大鼠左肺原位移植模型,术后将受体大鼠随机分为两组:对照组和实验组。对照组术后生理盐水1ml/天灌胃,实验组术后落新妇甙1mg/kg/天灌胃,观察肺移植的存活时间、大鼠脾细胞T淋巴细胞转化率和脾淋巴细胞IL-2活性,以及外周血中活化T细胞凋亡。结果:与对照组相比,实验组脾细胞T淋巴细胞转化率明显降低,两组差异有显著意义（P<0.05）。移植大鼠脾淋巴细胞IL-2活性在实验组中为4.25±2.65UI/ml,对照组IL-2活性为23.46±1.82UI/ml,两组有显著差异（P<0.01）。实验组能有效的诱导急性排斥反应中活化T细胞凋亡。结论落新妇甙通过下调IL-2产生和抑制体内IFN-γmRNA,诱导活化T细胞凋亡,抑制T淋巴细胞增殖分化,广泛抑制了以T细胞为主的肺移植术后急性排斥反应,从而延长大鼠肺移植的存活时间。实验三活化T细胞信号凋亡传导通路在落新妇甙抑制肺移植排斥反应中作用目的:用大鼠左肺原位移植模型,探讨落新妇甙对大鼠肺移植排斥反应中活化T细胞p38丝裂原激活蛋白激酶（p38MAPK）和PI3K/Akt信号传导通路的影响。方法:建立大鼠左肺原位移植模型,在第30天提取大鼠外周血分离活化T细胞进行体外培养,并进行实验分组,AD组。A组（对照组）,行细胞培养;B组（落新妇甙组）,培养液中加入落新妇甙15mg/L;C组,落新妇甙（15mg/L）加p38MAPK抑制剂SB203580（5μmol/L）;D组,术后每天落新妇甙（15mg/L）加PI3K/Akt抑制剂LY294002（10μmol/L）。TUNEL法检测T淋巴细胞凋亡情况。RT-PCR和Western blot法检测T细胞p38MAPK和PI3K及Akt下游表达的情况。结果:B组（落新妇甙组）T细胞凋亡指数和p38MAPK表达明显高于对照组,而PI3K/Akt明显低于对照组。C组（落新妇甙加p38MAPK抑制剂组）T细胞凋亡和p38MAPK表达均明显低于B组（落新妇甙组）（P<0.01）,PI3K/Akt明显高于对照组,但均与对照组无显著差异（P>0.05）。D组（落新妇甙加PI3K/Akt抑制剂LY294002组）T细胞凋亡和PIK3/Akt表达明显高于对照组,p38MAPK明显低于对照组。结论:落新妇甙诱导大鼠肺移植排斥反应中活化T细胞凋亡与其激活p38MAPK信号传导通路、及抑制PI3K/Akt信号传导通路有关。

论文目录

• 前言
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 大鼠同种异体原位肺移植模型的建立
• 一、材料与方法
• 二、结果
• 三、讨论
• 四、小结
• 参考文献
• 第二部分 落新妇甙对大鼠肺移植急性排斥反应的抑制作用
• 一、动物及药品
• 二、主要仪器设备及药品配置
• 三、实验方法
• 四、统计学方法
• 五、结果
• 六、讨论
• 七、结论
• 参考文献
• 第三部分 落新妇甙对大鼠肺移植急性排斥反应抑制作用的实验研究
• 实验一 落新妇甙对肺移植大鼠外周血活化T 细胞动态影响
• 一、材料及药品
• 二、主要手术器械、实验仪器及溶液配置
• 三、实验方法
• 四、统计学处理
• 五、结果
• 六、讨论
• 七、小结
• 参考文献
• 第四部分 落新妇甙对大鼠肺移植急性排斥反应抑制作用的实验研究
• 实验二 落新妇甙诱导移植肺活化T 细胞凋亡减轻急性排斥反应
• 一、实验材料、试剂及药品
• 二、实验仪器与药品配置
• 三、实验方法
• 四、统计学处理
• 五、结果
• 六、讨论
• 七、结论
• 参考文献
• 第五部分 落新妇甙对大鼠肺移植急性排斥反应抑制作用的实验研究
• 实验三 落新妇甙对肺移植排斥反应中活化T 细胞凋亡信号传导通路的研究
• 一、材料与方法
• 二、实验方法
• 三、统计学处理
• 四、结果
• 五、讨论
• 六、结论
• 参考文献
• 附录一 主要溶液配制
• 附录二 实验仪器、材料
• 附录三 在读期间发表论文目录
• 致谢