论文摘要
五味子为木兰科多年生落叶木质藤本植物,《中华人民共和国药典》收录有两种五味子药材,分别为北五味子和南五味子（华中五味子）的成熟果实。《神农本草》中将五味子列为上品,具有益气强阴、养五脏、明目壮筋骨等多种功效。现代药理学研究表明,五味子具有护肝、抗氧化、抗肿瘤、免疫调节、血管舒张及呼吸兴奋等多种药理作用。目前,五味子的化学成分研究比较深入,已报道的有木脂素、三萜、倍半萜、有机酸、挥发油和多糖等成分。由于对人体有多方面的有益作用,五味子的应用范围也愈来愈广泛,是一种应用价值高、开发前景十分广阔的食药经济型植物。五味子乙素（Shiandrin B,Sch B）为木脂素类,是五味子的主要活性成分之一。Sch B是具有较强抗氧化作用的天然成分,其作用强度高于强抗氧化剂维生素E。目前对五味子乙素的药理学作用研究还不够系统、深入,除抗氧化作用外,五味子乙素目前比较明确的药理学作用还有护肝、增敏抗肿瘤药物及抗肿瘤等。肿瘤已成为当前威胁人类最严重的常见病之一。近年来,广大学者对中药进行了广泛的研究,发掘出许多具有抗癌活性的中药,这些中药除了直接的细胞毒作用外,还可以通过诱导肿瘤细胞分化及凋亡、抑制端粒酶的活性、逆转肿瘤细胞多药耐药性、调节免疫系统、阻断肿瘤细胞迁移通路及基因水平调节、抑制肿瘤血管生成等途径,抑制肿瘤的生长及其转移、或增加其他抗肿瘤药物的敏感性等机制发挥抗肿瘤作用。其中,由于肿瘤血管在肿瘤发生、发展及转移中的作用和地位,评价肿瘤新生血管成为目前研究肿瘤生物学的热点之一。血管内皮细胞生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）是目前所知作用最强的促血管生成因子,它能在低氧情况下特异性刺激血管内皮细胞增殖和迁移,促进肿瘤血管构建。VEGF的表达与肿瘤血管形成的关系己被许多实验所证实,其阻断剂对动物和人的肿瘤均显示直接和迅速的抗血管作用。VEGF基因的启动子有HIF-1α结合位点,受HIF-1α转录调控,HIF-1α的激活将增加VEGF的基因表达。HIF-1α本身主要受缺氧调控,广泛参与哺乳动物细胞中缺氧诱导产生的特异应答,在缺氧诱导的基因表达调节中起着关键作用。五味子乙素具有较强的抗氧化作用,天然抗氧化剂目前已广泛应用于肿瘤的辅助治疗。肿瘤在机体本身的过度生长必然造成肿瘤本身的缺血缺氧,为改善这种状况,肿瘤通过各种途径促进血管的增生维持自身的生长和转移,VEGF途径是其中主要的途径之一。由于VEGF主要在肿瘤、缺氧及细胞因子刺激时大量表达,而五味子乙素又是作用较强的天然抗氧化剂,因此本实验以VEGF及其上游细胞调控因子HIF-1α为切入点,旨在探讨五味子乙素对肿瘤的作用及其可能作用机制。本课题首先利用MTT法、肿瘤体内接种法,研究了五味子乙素体外对人神经胶质瘤U251细胞增殖及及体内对荷瘤裸鼠肿瘤生长的影响。由于肿瘤的过度生长必然造成肿瘤本身一定的缺血缺氧,本课题以细胞的缺氧培养模拟肿瘤在体内生长的状态,分别在常氧及缺氧状态下,采用RT-PCR、实时荧光定量PCR、ELISA和Western blotting等实验手段检测了五味子乙素作用前后U251细胞的VEGF和HIF-1α两种细胞因子的mRNA及蛋白表达,并探讨其与Sch B作用时问、剂量的关系,主要实验结果如下:1、五味子乙素单药体外处理对U251细胞增殖没有抑制作用。2、Sch B对荷U251实体瘤裸小鼠表现出一定的抑瘤作用,且抑瘤作用有随剂量增加而增强的趋势。3、常氧状态下U251细胞的VEGF表达量很低,Sch B处理对细胞的VEGF表达没有影响;缺氧可以诱导U251细胞VEGF mRNA的表达增加,Sch B可以抑制上述行为并具有剂量依赖效应。4、常氧状态下,U251细胞的VEGF蛋白分泌量很低,Sch B处理对细胞分泌VEGF蛋白的影响无显著性差异;缺氧可以诱导U251细胞VEGF蛋白的分泌增加,Sch B可以抑制上述行为并具有时间及剂量依赖效应。5、常氧状态下,U251细胞HIF-1α表达量很低,Sch B处理对细胞HIF-1α表达没有影响;缺氧可以诱导细胞HIF-1α表达增加,而Sch B抑制了这一行为并具有剂量依赖效应。6、常氧状态下,U251细胞HIF-1α蛋白表达很低,Sch B处理对常氧状态下的细胞HIF-1α表达蛋白没有影响:缺氧可以诱导细胞HIF-1α蛋白表达增加,而Sch B抑制了这一行为。五味子乙素单药体外处理对U251细胞没有抑制作用,而体内实验则对U251实体瘤裸小鼠表现出一定的抑瘤作用,且抑瘤作用随剂量增加有增强的趋势,说明Sch B具有一定的整体抗U251肿瘤作用,但作用的机制是细胞毒以外的某种途径。肿瘤的发生发展过程中,当肿瘤生长到一定程度时,必然由于过度的生长造成局部环境的缺血缺氧,在缺氧的刺激下,肿瘤细胞通过多种途径如分泌HIF-1α等细胞因子上调VEGF,后者进而刺激血管内皮细胞增殖及血管形成,并通过增加毛细血管通透性的作用,导致血管内大分子物质的漏出,促进血管外基质的形成,为血管内皮细胞的增殖、血管的形成提供支架,辅助血管形成。新的肿瘤血管生成后,在一定程度上缓解了肿瘤细胞的缺血缺氧,促进了肿瘤细胞的生长,同时由于新生肿瘤血管基底膜的不完整,也容易导致肿瘤细胞的播散转移。上述过程会随着肿瘤的不断增大而往复循环。本实验以缺氧培养模拟肿瘤细胞在体内的生长坏境,结果证实,在缺氧环境下,Sch B可以抑制细胞HIF-1α、VEGF因子及其二者蛋白的表达,并具有一定的时间依赖和剂量依赖效应。由于HIF-1α是VEGF的主要上游调控因子,结合本课题研究结果,我们推断Sch B可能通过（或部分通过）HIF-1α途径下调了细胞VEGF水平。VEGF是目前所知作用最强的促血管生成因子,在低氧情况下VEGF可以特异性刺激血管内皮细胞增殖和迁移、促进肿瘤血管的构建;而Sch B是较强的抗氧化剂、具有清除氧自由基的作用,因此我们推断Sch B体内抗肿瘤作用可能是通过阻断（或部分阻断）由VEGF所介导的肿瘤血管生成而实现的。当然,肿瘤血管的生成是多种因素作用的结果,肿瘤还可能通过其他途径或分泌其他细胞因子促进血管的生成,Sch B也可能通过其他途径或作用于其他细胞因子阻断血管生成,进而发挥其抗肿瘤或增敏抗肿瘤药物的作用。Sch B对肿瘤作用的确切机制尚有待进一步实验研究证实。
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