论文摘要
根据已报道的鸡淋巴细胞趋化因子(ChLptn)的cDNA序列中的开放阅读框架序列设计特异性引物,以科宝鸡的脾脏脾淋巴细胞的总RNA为模板进行RT-PCR。将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后回收,与克隆载体pGEM-T easy连接后,并转化E. coli DH 5α,在含氨苄青霉素的LB平板上选择培养后,挑取白色菌落于LB液体培养基中振荡培养。用此培养物作模板,进行PCR鉴定。将PCR鉴定为阳性的转化单菌落接种于LB(含AMP)培养基中,过夜培养后抽提质粒用EcoR Ⅰ进行酶切鉴定,取阳性克隆进行测序分析。测序结果表明PCR产物(ORF)全长294bp,其中第1-291位是该基因的阅读框架(ORF),由291bp组成,编码97个氨基酸。经DNAssist V1.02比对分析,所克隆基因与GenBank中收录的鸡ChLptn基因序列(cDNA)的同一性为99.66%,表明成功克隆获得了鸡淋巴细胞趋化因子基因的ORF。DNAssist分析表明,所克隆基因编码的蛋白质分子量为11kDa,等电点为10.9。 以克隆的cDNA序列中的ORF序列为基础,分析pET-32a(+)的酶切图谱,用Premier Primer 5.0设计引物,以E. coli DH 5α(pGEM-T-easy-ChLptn)为模板克隆ChLptn的ORF,与质粒载体pET-32a(+)连接。连接产物转化宿主细菌E. coli BL21(DE3),再进行PCR和酶切鉴定及测序鉴定。将阳性转化菌落进行IPTG诱导表
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摘要ABSTRACT前言第一章 鸡淋巴细胞趋化因子基因ORF序列的克隆1.材料和方法1.1 材料1.1.1 主要仪器1.1.2 试验动物和饲料1.1.3 菌株、载体1.1.4 分子生物学试剂和试剂盒1.1.5 培养基1.1.6 引物1.1.7 鸡脾脏淋巴细胞分离用材料1.1.8 总RNA抽提用材料2法转化用材料'>1.1.9 CaCl2法转化用材料1.1.10 琼脂糖凝胶电泳材料1.2 方法1.2.1 鸡脾脏脾淋巴细胞的分离1.2.2 鸡脾脏脾淋巴细胞总RNA的抽提1.2.3 RT-PCR扩增ChLptn基因1.2.4 RT-PCR产物的回收纯化1.2.5 RT-PCR产物与pGEM-T-easy的连接2法)'>1.2.6 连接产物转化入E.coli DH5a(CaCl2法)1.2.7 转化克隆的PCR鉴定1.2.8 PCR阳性克隆的酶切鉴定1.2.8.1 用E.Z.N.A小量质粒制备试剂盒抽提PCR阳性克隆的质粒1.2.8.2 重组质粒的酶切鉴定1.2.8.3 阳性克隆的序列测定及分析2.结果2.1 ChLptn的RT-PCR扩增结果2.2 转化菌落的PCR鉴定2.3 重组质粒pGEM-T easy-ChLptn的酶切鉴定2.4 ChLptn基因的序列分析3.讨论第二章 ChLpin基因在大肠杆菌的表达1.材料和方法1.1 材料1.1.1 主要仪器1.1.2 菌株1.1.3 引物1.1.4 常用分子生物学试剂和试剂盒1.1.5 常规化学试剂2法所需材料'>1.1.6 CaCl2法所需材料1.1.7 培养基1.1.8 SDS-PAGE所需材料1.2 方法1.2.1 ChLptn的ORF的制备1.2.2 载体pET-32a(+)的制备1.2.3 pET-32a(+)与ChLptn(ORF)的连接2法将连接产物转化入宿主细菌E.coli BL21(DE3)'>1.2.4 用CaCl2法将连接产物转化入宿主细菌E.coli BL21(DE3)1.2.5 PCR鉴定转化克隆1.2.6 PCR阳性克隆的酶切鉴定1.2.7 ChLptn在E.coli BL21(DE3)的诱导表达2. 结果2.1 ChLptn(ORF)的扩增2.2 阳性重组表达质粒的PCR鉴定2.3 阳性重组表达质粒的酶切鉴定2.4 重组ChLptn基因的序列分析2.5 重组ChLptn基因的表达动态和SDS-PAGE分析3. 讨论第三章 ChLptn基因在毕赤酵母中的表达1.材料和方法1.1 材料1.1.1 主要仪器1.1.2 菌株1.1.3 引物1.1.4 常用分子生物学试剂和试剂盒1.1.5 常规化学试剂2法所需材料'>1.1.6 CaCl2法所需材料1.1.7 培养基1.1.8 培养基中所用的储存液1.1.9 SDS-PAGE所需材料1.2 方法1.2.1 ChLptn(ORF-A)和ChLptn(ORF-B)的制备1.2.2 载体pPIC9k的制备1.2.3 pPIC9k与ChLptn(ORF-A)和ChLptn(ORF-B)的连接2法将连接产物转化入宿主细菌E.coli DH5a'>1.2.4 用CaCl2法将连接产物转化入宿主细菌E.coli DH5a1.2.5 PCR法鉴定转化克隆1.2.6 PCR阳性克隆的酶切鉴定1.2.7 pPIC9k-ChLptn(A)和pPIC9k-ChLptn(B)重组质粒的序列分析1.2.8 pPIC9k-ChLptn(A)和pPIC9k-ChLptn(B)的线性化1.2.9 用电转化法将线性化的重组质粒pPIC9k-ChLptn(A)和pPIC9k-ChLptn(B)转化入宿主菌Pichia Pastoris1.2.10 对电转化后的重组菌落进行表型筛选1.2.11 对酵母中的重组菌落进行PCR鉴定1.2.12 pPIC9k-ChLptn(A)和pPIC9k-ChLptn(B)在酵母中的诱导表达2. 结果2.1 ChLptn(ORF-A)和ChLptn(ORF-B)的扩增2.2 阳性重组表达质粒的PCR鉴定2.3 阳性重组表达质粒的酶切鉴定2.4 pPIC9k-ChLptn(A)和pPIC9k-ChLptn(B)重组质粒的序列分析2.5 对转化的重组菌落进行表型筛选结果3. 讨论小结参考文献文献综述附录附录 1:缩写词表及英汉对照附录 2:GenBank登陆的ChLptn基因的序列及酶切位点分析图谱附录 3:质粒pGEM-T-easy图谱附录 4:质粒pET-32a(+)图谱附录 5:质粒pPIC9k图谱附录 6:ChLptn基因克隆入pPGEM- easy载体的测序结果附录 7:ChLptn基因在大肠杆菌中表达构建重组质粒的测序结果附录 8:ChLptn(ORF-A)基因在酵母中表达构建重组质粒的测序结果附录 9:ChLptn(ORF-B)基因在酵母中表达构建重组质粒的测序结果致谢原创性声明及版权使用授权说明
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