鸡淋巴细胞趋化因子基因的克隆及表达研究

鸡淋巴细胞趋化因子基因的克隆及表达研究

论文摘要

根据已报道的鸡淋巴细胞趋化因子(ChLptn)的cDNA序列中的开放阅读框架序列设计特异性引物,以科宝鸡的脾脏脾淋巴细胞的总RNA为模板进行RT-PCR。将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后回收,与克隆载体pGEM-T easy连接后,并转化E. coli DH 5α,在含氨苄青霉素的LB平板上选择培养后,挑取白色菌落于LB液体培养基中振荡培养。用此培养物作模板,进行PCR鉴定。将PCR鉴定为阳性的转化单菌落接种于LB(含AMP)培养基中,过夜培养后抽提质粒用EcoR Ⅰ进行酶切鉴定,取阳性克隆进行测序分析。测序结果表明PCR产物(ORF)全长294bp,其中第1-291位是该基因的阅读框架(ORF),由291bp组成,编码97个氨基酸。经DNAssist V1.02比对分析,所克隆基因与GenBank中收录的鸡ChLptn基因序列(cDNA)的同一性为99.66%,表明成功克隆获得了鸡淋巴细胞趋化因子基因的ORF。DNAssist分析表明,所克隆基因编码的蛋白质分子量为11kDa,等电点为10.9。 以克隆的cDNA序列中的ORF序列为基础,分析pET-32a(+)的酶切图谱,用Premier Primer 5.0设计引物,以E. coli DH 5α(pGEM-T-easy-ChLptn)为模板克隆ChLptn的ORF,与质粒载体pET-32a(+)连接。连接产物转化宿主细菌E. coli BL21(DE3),再进行PCR和酶切鉴定及测序鉴定。将阳性转化菌落进行IPTG诱导表

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 前言
  • 第一章 鸡淋巴细胞趋化因子基因ORF序列的克隆
  • 1.材料和方法
  • 1.1 材料
  • 1.1.1 主要仪器
  • 1.1.2 试验动物和饲料
  • 1.1.3 菌株、载体
  • 1.1.4 分子生物学试剂和试剂盒
  • 1.1.5 培养基
  • 1.1.6 引物
  • 1.1.7 鸡脾脏淋巴细胞分离用材料
  • 1.1.8 总RNA抽提用材料
  • 2法转化用材料'>1.1.9 CaCl2法转化用材料
  • 1.1.10 琼脂糖凝胶电泳材料
  • 1.2 方法
  • 1.2.1 鸡脾脏脾淋巴细胞的分离
  • 1.2.2 鸡脾脏脾淋巴细胞总RNA的抽提
  • 1.2.3 RT-PCR扩增ChLptn基因
  • 1.2.4 RT-PCR产物的回收纯化
  • 1.2.5 RT-PCR产物与pGEM-T-easy的连接
  • 2法)'>1.2.6 连接产物转化入E.coli DH5a(CaCl2法)
  • 1.2.7 转化克隆的PCR鉴定
  • 1.2.8 PCR阳性克隆的酶切鉴定
  • 1.2.8.1 用E.Z.N.A小量质粒制备试剂盒抽提PCR阳性克隆的质粒
  • 1.2.8.2 重组质粒的酶切鉴定
  • 1.2.8.3 阳性克隆的序列测定及分析
  • 2.结果
  • 2.1 ChLptn的RT-PCR扩增结果
  • 2.2 转化菌落的PCR鉴定
  • 2.3 重组质粒pGEM-T easy-ChLptn的酶切鉴定
  • 2.4 ChLptn基因的序列分析
  • 3.讨论
  • 第二章 ChLpin基因在大肠杆菌的表达
  • 1.材料和方法
  • 1.1 材料
  • 1.1.1 主要仪器
  • 1.1.2 菌株
  • 1.1.3 引物
  • 1.1.4 常用分子生物学试剂和试剂盒
  • 1.1.5 常规化学试剂
  • 2法所需材料'>1.1.6 CaCl2法所需材料
  • 1.1.7 培养基
  • 1.1.8 SDS-PAGE所需材料
  • 1.2 方法
  • 1.2.1 ChLptn的ORF的制备
  • 1.2.2 载体pET-32a(+)的制备
  • 1.2.3 pET-32a(+)与ChLptn(ORF)的连接
  • 2法将连接产物转化入宿主细菌E.coli BL21(DE3)'>1.2.4 用CaCl2法将连接产物转化入宿主细菌E.coli BL21(DE3)
  • 1.2.5 PCR鉴定转化克隆
  • 1.2.6 PCR阳性克隆的酶切鉴定
  • 1.2.7 ChLptn在E.coli BL21(DE3)的诱导表达
  • 2. 结果
  • 2.1 ChLptn(ORF)的扩增
  • 2.2 阳性重组表达质粒的PCR鉴定
  • 2.3 阳性重组表达质粒的酶切鉴定
  • 2.4 重组ChLptn基因的序列分析
  • 2.5 重组ChLptn基因的表达动态和SDS-PAGE分析
  • 3. 讨论
  • 第三章 ChLptn基因在毕赤酵母中的表达
  • 1.材料和方法
  • 1.1 材料
  • 1.1.1 主要仪器
  • 1.1.2 菌株
  • 1.1.3 引物
  • 1.1.4 常用分子生物学试剂和试剂盒
  • 1.1.5 常规化学试剂
  • 2法所需材料'>1.1.6 CaCl2法所需材料
  • 1.1.7 培养基
  • 1.1.8 培养基中所用的储存液
  • 1.1.9 SDS-PAGE所需材料
  • 1.2 方法
  • 1.2.1 ChLptn(ORF-A)和ChLptn(ORF-B)的制备
  • 1.2.2 载体pPIC9k的制备
  • 1.2.3 pPIC9k与ChLptn(ORF-A)和ChLptn(ORF-B)的连接
  • 2法将连接产物转化入宿主细菌E.coli DH5a'>1.2.4 用CaCl2法将连接产物转化入宿主细菌E.coli DH5a
  • 1.2.5 PCR法鉴定转化克隆
  • 1.2.6 PCR阳性克隆的酶切鉴定
  • 1.2.7 pPIC9k-ChLptn(A)和pPIC9k-ChLptn(B)重组质粒的序列分析
  • 1.2.8 pPIC9k-ChLptn(A)和pPIC9k-ChLptn(B)的线性化
  • 1.2.9 用电转化法将线性化的重组质粒pPIC9k-ChLptn(A)和pPIC9k-ChLptn(B)转化入宿主菌Pichia Pastoris
  • 1.2.10 对电转化后的重组菌落进行表型筛选
  • 1.2.11 对酵母中的重组菌落进行PCR鉴定
  • 1.2.12 pPIC9k-ChLptn(A)和pPIC9k-ChLptn(B)在酵母中的诱导表达
  • 2. 结果
  • 2.1 ChLptn(ORF-A)和ChLptn(ORF-B)的扩增
  • 2.2 阳性重组表达质粒的PCR鉴定
  • 2.3 阳性重组表达质粒的酶切鉴定
  • 2.4 pPIC9k-ChLptn(A)和pPIC9k-ChLptn(B)重组质粒的序列分析
  • 2.5 对转化的重组菌落进行表型筛选结果
  • 3. 讨论
  • 小结
  • 参考文献
  • 文献综述
  • 附录
  • 附录 1:缩写词表及英汉对照
  • 附录 2:GenBank登陆的ChLptn基因的序列及酶切位点分析图谱
  • 附录 3:质粒pGEM-T-easy图谱
  • 附录 4:质粒pET-32a(+)图谱
  • 附录 5:质粒pPIC9k图谱
  • 附录 6:ChLptn基因克隆入pPGEM- easy载体的测序结果
  • 附录 7:ChLptn基因在大肠杆菌中表达构建重组质粒的测序结果
  • 附录 8:ChLptn(ORF-A)基因在酵母中表达构建重组质粒的测序结果
  • 附录 9:ChLptn(ORF-B)基因在酵母中表达构建重组质粒的测序结果
  • 致谢
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