稳定表达不同动物犬瘟热病毒受体SLAM的Vero细胞系的建立

论文摘要

犬瘟热（Canine distemper, CD）是由犬瘟热病毒（Canine distemper virus, CDV）病毒引起的一种高度接触性传染病。该病是养犬业、毛皮动物养殖业危害最大的传染病病之一,可引起大批犬、貂、狐等动物发病,发病死亡率为3080%,雪貂高达100%。病毒分离技术是对CDV特性的研究的重要手段,但具有囊膜的CDV不易在环境中存活,因此难以用普通方法分离成功,限制其对CDV的研究。信号淋巴细胞激活分子（Signaling Lymphocyte Activation Molecule, SLAM）是CDV感染宿主的主要受体,本文旨在建立稳定表达不同动物（犬、狐狸、貉和水貂）SLAM的Vero细胞系,用于CDV分离和体外研究。用PCR的方法以克隆有犬、狐狸、貉和水貂SLAM的pMD18-T （分别命名pMD18-T-cSLAM、pMD18-T-fSLAM、pMD18-T-rSLAM和pMD18-T-mSLAM）为模板扩增目的基因片段,将其定向插入到真核表达载体pIRES2-EGFP中,得到重组表达载体pIRES2-EGFP-cSLAMh、pIRES2-EGFP-fSLAMh和pIRES2-EGFP-mSLAMh。将空载体和已构建完成的重组表达载体分别用脂质体法转染到Vero细胞,通过G418和EGFP筛选稳定表达的阳性Vero细胞。用免疫组化的方法证实SLAM在传了6代转染重组质粒的细胞内的表达。成功建立了稳定表达动物（犬、狐狸、貉和水貂）SLAM的Vero细胞系,分别命名为V-p-cSLAMh、V-p-fSLAMh、V-p-rSLAMh和V-p-mSLAMh细胞系。对建立的V-p-rSLAMh细胞系进行稳定性、病毒分离敏感性和分离CDV毒力评价。6次冻存复苏的V-p-rSLAMh细胞生长良好,说明细胞稳定性良好。将V-p-rSLAMh细胞系和Vero细胞分别接种3份CD阳性样品,接种3份样品后的细胞系在接毒36～48h形成典型的细胞病变（cytopathic effect, CPE）,而在Vero细胞连续盲传6代未见犬瘟热病毒典型CPE,可见建立的细胞系在分离CDV方面比Vero细胞敏感。以V-p-rSLAMh细胞系分离到的LN(（10）f1株CDV进行貉和狐狸攻毒实验,每只的攻毒剂量为4×102.39TCID50/只,攻毒组3只貉和狐狸在11～22d死亡,正常对照组貉和狐狸健康存活,说明分离的CDV LN（10）f1株具有较强毒力。H基因序列分析表明该CDV强毒属于Asia-1基因型。稳定表达SLAM的细胞系的建立为CDV的研究提供了一个有效的操作平台,同时也为CDV强毒株的获得提供保障。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 病原特征
• 1.2 犬瘟热病毒分离技术研究进展
• 1.2.1 原代细胞
• 1.2.2 传代细胞
• 1.2.3 稳定表达SLAM的细胞系
• 1.3 本课题研究的目的及内容
• 第2章 表达不同动物犬瘟热病毒受体SLAM的Vero细胞系的建立
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 质粒、菌株与细胞
• 2.1.2 主要的试剂和仪器
• 2.1.3 常用溶液和培养基的配置
• 2.1.4 PCR 扩增与基因克隆
• 2.1.5 真核表达载体的构建
• 2.1.6 G418最适浓度的确定
• 2.1.7 转染用高纯度质粒的制备
• 2.1.8 细胞转染
• 2.1.9 瞬时转染后分离病毒验证
• 2.1.10 稳定转染细胞的克隆筛选
• 2.1.11 稳定转染细胞系蛋白表达的验证
• 2.1.12 绘制细胞生长曲线
• 2.2 结果
• 2.2.1 目的条带的获得
• 2.2.2 真核表达载体获得及酶切鉴定
• 2.2.3 G418加压筛选浓度的确定
• 2.2.4 Vero细胞瞬时转染及转染后对细胞敏感性的影响
• 2.2.5 稳定转染的Vero细胞系的建立
• 2.2.6 细胞免疫组化检测目的蛋白的表达
• 2.2.7 细胞生长曲线
• 2.3 讨论
• 第3章 建立的表达貉SLAM受体的Vero细胞系的评价
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 细胞、实验动物及病毒
• 3.1.2 主要的试剂和仪器设备
• 3.1.3 细胞对CDV 的敏感性
• 3.1.4 分离到病毒的RT-PCR 验证及Ｈ基因扩增
• 3.1.5 病毒滴定
• 3.1.6 用V-p-rSLAMh细胞分离到的LN（10）f1株细胞毒攻毒实验
• 3.2 结果
• 3.2.1 三株野毒株在两种细胞的培养情况
• 3.2.2 分离病毒的PCR 验证
• 3.2.3 LN（10）f1株CDVＨ基因序列比对及进化树构建
• 3.2.4 动物攻毒实验
• 3.3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学位论文
• 致谢