猪繁殖与呼吸综合征直接免疫荧光诊断方法的建立及其应用

论文摘要

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征由病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）感染引起的,以妊娠母猪流产、死产、弱仔等繁殖障碍、仔猪呼吸困难、高死亡率及育肥猪呼吸道症状为主要特征,部分发病猪临床表现为耳部皮肤发绀,俗称“蓝耳病”。自2006年6月开始,在我国江西、湖南、湖北、安徽等省部分地区猪群中暴发了以持续高热、呼吸困难、皮肤发绀及母猪繁殖障碍、高发病率和死亡率为主要特征的重大疫情,临床上称之为“猪高热综合征”,给养猪业造成了极其巨大的经济损失。病原学研究表明,引起该病的主要病原体为高致病性PRRSV变异毒株。对高致病性PRRSV变异毒株的病原学诊断目前主要依靠RT-PCR技术,由于该方法需要较好的实验设备,加之检测费用高,无法在临床上大规模推广应用。本研究以临床“高热综合征”病例中分离到的高致病性PRRSV-HBR变异株接种健康仔猪制备抗血清,采用硫酸铵盐析法提取血清中免疫球蛋白（IgG）,并用异硫氰酸荧光素（FITC）对IgG进行荧光标记,通过优化反应条件,建立一种用于检测病毒感染单层细胞及动物脏器组织切片中PRRSV抗原的直接免疫荧光（DIFA）诊断方法。应用该方法检测PRRSV感染MARC-145细胞增殖动力学的结果表明,接种后16h抗原阳性细胞开始出现,于60h～72h达到病毒增殖高峰,96h后感染细胞崩解。对PRRSV人工感染猪组织脏器抗原分布的检测结果显示,腹股沟淋巴结、空肠、睾丸、脾脏、下颌淋巴结、肠系膜淋巴结和扁桃体的抗原阳性检测率较高;对来源于山东、内蒙古、吉林、黑龙江等地10个猪场的38份临床病料的PRRSV平均阳性检出率为63.2%（24/38）。该方法具有特异性强、敏感性和重复性好等特点,与RT-PCR检测结果符合率为96.3%,对几种已知猪病毒抗原无交叉反应,标记的荧光抗体于4℃保存6个月稳定。本研究为猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）的临床诊断提供了一种快速、敏感、特异、有效的检测手段。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒分子生物学研究进展
• 1.1.1 PRRSV 概述
• 1.1.2 病毒的基因组结构
• 1.1.3 病毒基因组的转录及表达
• 1.1.4 病毒基因组所编码的蛋白
• 1.2 猪繁殖与呼吸综合征诊断方法研究进展
• 1.2.1 流行病学与临床诊断
• 1.2.2 病原学诊断
• 1.2.3 血清学诊断
• 1.3 研究的目的和意义
• 2 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 毒株与细胞系
• 2.1.2 实验动物
• 2.1.3 主要试剂和溶液
• 2.1.4 引物
• 2.1.5 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 猪抗PRRSV 高免血清的制备
• 2.2.2 免疫球蛋白IgG 的提取
• 2.2.3 免疫球蛋白IgG 的荧光标记
• 2.2.4 PRRSV DIFA 操作程序
• 2.2.5 PRRSV DIFA 反应条件的优化
• 2.2.6 PRRSV DIFA 的特异性、敏感性、重复性及保存期试验
• 2.2.7 PRRSV-HBR 毒株增殖情况测定
• 2.2.8 人工感染猪及临床病料的采集
• 2.2.9 与RT-PCR 方法比较试验
• 3 结果
• 3.1 PRRSV DIFA 反应条件的确定
• 3.2 PRRSV DIFA 的特异性、敏感性、重复性及保存期
• 3.3 PRRSV-HBR 毒株增殖情况检测结果
• 3.4 人工感染猪及临床发病猪组织样品检测结果
• 3.4.1 人工感染猪临床表现
• 3.4.2 人工感染猪各组织脏器病毒检出情况及分布特点
• 3.4.3 DIFA 与RT-PCR 检测符合率
• 3.4.4 临床发病猪组织样品检测结果
• 4 讨论
• 4.1 免疫荧光染色的影响因素
• 4.2 与其它诊断方法的比较
• 4.3 PRRSV DIFA 的应用
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文