Survivin、Bax基因与人晶状体上皮细胞增殖凋亡的实验研究

论文摘要

前言后发性白内障又称晶状体后囊膜混浊（posterior capsule opacification,PCO）,是目前白内障术后导致视力下降的最主要并发症。研究指出PCO的发生率从5%至50%不等;儿童白内障患者若术中保留后囊膜,PCO的发生率几乎100%。激光后囊膜切开术是目前治疗PCO的主要方法,但该方法有可能引起其他并发症,如视网膜脱离、黄斑囊样水肿、继发性青光眼、人工晶状体（intraocular lens,IOL）激光损伤及IOL移位等。对于儿童,由于其无法配合,这一方法也难以适用。而现有的其他预防PCO发生方法,如白内障手术技术改进、IOL设计,以及各种抗增殖药物的应用,虽然在一定程度上降低了PCO的发生率,但都没有从根本上解决这一问题。因此,探索新的PCO防治途径具有重要意义。近年来研究表明PCO形成的病理过程主要为白内障术后赤道部的晶状体上皮细胞（lens epithelial cells,LECs）过度增殖并移行至晶状体后囊膜,其中大量细胞发生上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）并分化为成纤维细胞。而白内障术后房水中细胞因子如转化生长因子β（transforming growthfactorβ,TGF-β）、成纤维生长因子（fibroblast growth factor,FGF）等浓度改变是造成LECs的增殖,移行,分化的重要因素。目前PCO基因治疗的研究主要集中于自杀基因、细胞周期调控基因和细胞因子相关基因。这些方法为PCO的治疗提供了新思路,但仍存在一些缺陷。而本研究拟通过进行有关凋亡基因的转导来实现对LECs增殖的抑制。细胞凋亡（apoptosis）又称程序性细胞死亡（programmed cell death,PCD）,是受基因调控的细胞主动自杀过程。Bax/Bcl-2以及Survivin是细胞凋亡通路上的重要调控基因,TGF-β与FGF信号通路中也可以观察到上述基因表达的改变。研究表明抑制Bcl-2、Survivin基因或者增强Bax基因表达均可有效抑制肿瘤细胞的生长,明显增强放疗或化疗对肿瘤细胞的杀伤作用。本研究首先对TGF-β与FGF作用下体外培养的人晶状体上皮细胞（humanlens epithelial cells,HLECs）的增殖情况进行观察,检测Bax、Bcl2、Survivin基因表达的变化;并通过脂质体Bax基因转染以及siRNA技术沉默Survivin表达,从而诱导对HLECs细胞的凋亡,比较不同方法对HLECs凋亡的作用,为基因治疗PCO提供新思路。第一部分Survivin、Bax与生长因子诱导下人晶状体上皮细胞增殖凋亡的关系目的比较TGF-β与FGF作用下HLECs增殖过程中Survivin与Bcl-2/Bax基因的表达变化。方法体外培养HLECs系SRA01/04,并分别加入不同浓度的TGF-β与FGF。通过相差显微镜观察HLECs的增殖情况,同时采用CCK-8方法检测细胞增殖率。应用Western Blot与RT-PCR技术检测HLECs中Bcl-2、Bax、Survivin基因的表达情况。结果随着浓度的增加,TGF-β能抑制HLECs的增殖,而FGF能够促进HLECs的增殖,且TGF-β对HLECs的抑制作用能被FGF所阻断。TGF-β作用下Survivin与Bcl-2基因表达下调,Bax基因表达上调。而FGF作用下,可检测到Survivin与Bcl-2的表达上调,Bax表达下调。结论在细胞因子促进或抑制晶状体上皮细胞增殖过程中,细胞内凋亡调控因子如Bcl-2,Bax,Survivin表达水平也发生变化,参与细胞增殖的调控。第二部分Bax基因转染人晶状体上皮细胞诱导凋亡目的观察EGFP-N1-Bax质粒转染后HLECs,Bax基因的表达情况及其对细胞凋亡的影响。方法对体外培养的HLECs采用脂质体技术对进行Bax基因转染。在转染后48小时,采用相差显微镜与流式细胞仪观察Bax基因转染情况。以RT-PCR的方法检测Bax基因mRNA表达,Western Blot法检测Bax基因蛋白表达蛋白的表达。流式细胞仪联合Annexin V染色法检测转染成功的HLECs的凋亡情况。结果采用流式细胞仪检测的EGFP-N1-Bax的转染效率为45.47±1.30%。转染后48hr,EGFP-N1-Bax组细胞Bax蛋白与mRNA的表达量较对照组均表达上升,流式细胞仪检测细胞凋亡率为23.98±1.88%。转染后细胞内survivin基因表达下调,而Bcl-2 mRNA表达也发生下调。结论EGFP-N1-Bax质粒转染HLECs后成功表达Bax基因,诱导细胞凋亡。细胞内Bcl-2/Bax比值,Survivin表达也发生相应变化。第三部分Survivin siRNA转染对人晶状体上皮细胞凋亡的影响目的通过siRNA转染抑制Survivin基因表达,诱导HLECs凋亡;并联合EGFP-N1-Bax质粒转染诱导细胞凋亡。方法经脂质体法将siRNA转染至HLECs。转染后48小时,采用相差显微镜与流式细胞仪观察siRNA转染情况。并分别以Western Blot、RT-PCR方法检测三对Survivin siRNA对HLECs中Survivin基因蛋白表达、mRNA表达的影响。流式细胞仪联合Annexin V染色法检测转染成功的HLECs的凋亡效率。选择诱导凋亡效率最好的一对Survivin siRNA联合EGFP-N1-Bax共转染HLECs,采用同样方法观察细胞凋亡情况。结果采用流式细胞仪检测siRNA转染HLECs的效率为56.58±2.67%。转染后48小时,Survivin siRNA-51组细胞的Survivin蛋白与mRNA的表达量较其余各组明显下调。流式细胞仪联合Annexin V方法检测显示该组细胞凋亡率为24.49±2.42%。联合EGFP-N1-Bax共转染HLECs后,细胞内Bax表达上调,Survivin与Bcl-2表达下调。HLECs凋亡率为33.28±2.69%。结论通过RNA干扰方法抑制Survivin mRNA表达翻译可成功诱导HLECs发生凋亡。联合EGFP-N1-Bax共转染HLECs可以明显提高凋亡效率。全文小结1.FGF与TGF-β调控HLECs细胞增殖过程中,凋亡相关蛋白Bax、Survivin也参与其中,各自表达都发生一定变化。2.EGFP-N1-Bax质粒转染HLECs后可上调Bax表达,下调Bcl-2/Bax比值与Survivin表达并诱导细胞凋亡。3.RNA干扰技术可成功下调HLECs内Survivin表达,诱导细胞凋亡。4.Survivin siRNA联合EGFP-N1-Bax共转染HLECs可以明显提高凋亡效率

论文目录

• 英文缩略语注释
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 Survivin、Bax与生长因子诱导下人晶状体上皮细胞增殖凋亡的关系
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第二部分 Bax基因转染人晶状体上皮细胞诱导凋亡
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第三部分 Survivin siRNA转染对人晶状体上皮细胞凋亡的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 全文总结
• 参考文献
• 附录一 综述
• 参考文献
• 附录二 在读期间发表论文情况
• 致谢