论文摘要
本论文克隆了9种鲽形目鱼类的生长激素基因cDNA序列并运用PAUP软件进行了分子系统进化树分析,构建了四种不同类型的酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）表达牙鲆生长激素的载体,并研究了牙鲆生长激素基因在酿酒酵母中的表达情况。从7种重要鲽形目经济鱼类——高眼鲽（Cleisthenes herzensteini）、黄盖鲽（Limanda yokohamae）、木叶鲽（Pleuronichthys Cornutus）、宽体舌鳎（Cynoglossusrobustus）、石鲽（Platichthys bicoloratus）和条鳎（Zebrias zebra）、夏鲆（Paralichthysdentatus）的脑垂体中提取mRNA,并采用RT-PCR方法,根据已克隆得到的鲆鲽鱼类生长激素基因的保守性序列设计特异性引物,克隆了含开放阅读框的生长激素（Growth Hormone,GH）cDNA序列,测序结果显示,高眼鲽、黄盖鲽、木叶鲽、宽体舌鳎、石鲽、条鳎和夏鲆的GH cDNA长度依次为479 bp、564 bp、519 bp、440 bp、564 bp、440 bp和522 bp,编码140-170个氨基酸的成熟GH多肽片段;从漠斑牙鲆（Paralichthys lethostigma）和大菱鲆（Scophthalmus maximus）脑垂体中提取mRNA,利用SMART-RACE技术建立脑垂体cDNA文库,并从该文库中克隆出大菱鲆和漠斑牙鲆生长激素基因cDNA全长序列。测序结果表明,克隆的大菱鲆GH cDNA序列全长为876 bp,包括108 bp的5’UTR和174 bp的3’UTR序列,开放阅读框全长591 bp,编码由197氨基酸残基组成的生长激素成熟肽序列,漠斑牙鲆GH cDNA序列全长为902 bp,包括131 bp的5’UTR和198 bp的3’UTR序列,开放阅读框全长570 bp,编码由190氨基酸残基组成的生长激素成熟肽序列。运用PAUP软件对15种鲽形目鱼类与另外7种不同种属鱼类进行了分子系统进化树分析,结果与根据传统的形态学和生化特征分类进化地位基本一致,在15种鲽形目鱼类中只有大菱鲆和塞内加尔鳎各自单独形成一个分支且与鲆科和鲽科鱼类相距较远,其中塞内加尔鳎等种类的分类地位与根据线粒体DNA序列分析的系统发生模式基本吻合。说明生长激素基因可以有效地用于研究鲽形目等硬骨鱼类的亲缘关系及分类地位。通过将牙鲆生长激素基因,插入酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）表面展示载体pYD1中,构建了非整合型载体pYD-GH,并在此基础上构建了三种整合型载体:适合于细胞外诱导表达的pYD-E2、细胞内诱导表达的pYD-E4和细胞内组成表达的pYD-EP4。将载体转化至酿酒酵母菌株EBY100中,得到转牙鲆生长激素酿酒酵母,对牙鲆生长激素在酿酒酵母中的表达和生物学活性进行了研究。非整合型载体pYD-GH无法在酵母细胞的传代中稳定存在而整合型载体pYD-E2、pYD-E4和pYD-EP4经过30代后的阳性检出率为100%,证明通过同源重组目的基因已经稳定整合到酵母基因组。对细胞外诱导表达的pYD-GH和pYD-E2转化酵母进行荧光标记,荧光显微镜和流式细胞仪分析外源基因表达情况,结果显示半乳糖诱导6小时的转化酵母即具有最高的荧光强度而12小时的转化酵母仍具有较高的荧光强度。经过计算,牙鲆生长激素在GAL为启动子的胞外表达工程菌E2中的表达量为1.02‰,在GAL为启动子的胞内表达工程菌E4中的表达量为1.49‰,而以PGK为启动子的胞内表达工程菌EP4的表达量为1.93‰。对表达了牙鲆生长激素的酿酒酵母进行生物活性检测,发现E2、E4和EP4在促进牙鲆生长、提高饵料转化率方面均有显著的作用,即使添加量仅有0.5%,在7周时间里体重增长分别比商品饲料对照组提高了27.16%、26.76%和31.21%,饵料转化率比对照组分别提高22.75%、22.34%和26.15%,随着酿酒酵母添加量的增加,作用更加显著,当酿酒酵母添加量达到1%,转基因酿酒酵母（E2、E4、EP4）组鱼的体重增长分别比商品饲料对照组提高了47.29%、46.87%和50.24%,饵料转化率比对照组分别提高30.65%、30.46%和32.07%。最后为评价转牙鲆生长激素基因酵母的安全性,将转基因酵母灌胃昆明种小鼠进行急性毒性试验、传统致畸试验、骨髓微核和精子畸形试验,急性毒性实验结果显示转牙鲆生长激素基因的酿酒酵母对小鼠均不具有毒性(LD50＞10g/kg)。另外在传统致畸试验、骨髓微核和精子畸形试验和小鼠组织器官影响实验中三种转基因酿酒酵母的三个剂量组（2.0g/kg、5.0g/kg及10.0g/kg）与对照组比较都没有显著性差异（P＞0.05）。证明转牙鲆生长因子基因酿酒酵母对小鼠不会产生致畸和致突变作用,可能是一种安全的转基因饲料添加剂。