编码水稻磷酸盐转运蛋白基因OrLPT1的克隆和表达研究

论文摘要

磷是高等植物生长必需的大量元素,主要由根系从土壤中吸收获得。水稻是世界的重要粮食作物,全球有二分之一左右人口以大米为主食。水稻土壤磷肥短缺现象,是全世界农业生产中限制水稻产量的一个重要因素。在大多数植物中,磷吸收系统由低亲和力和高亲和力两个部分组成;磷缺乏时,高亲和力转运系统是植物根中吸收磷的主要机制。目前,已经从很多高等植物如番茄、拟南芥等中分离出高亲和力磷酸盐转运蛋白,但有关水稻磷酸盐转运蛋白基因和功能的研究工作还很少,仍处于初级阶段。本研究从水稻中分离到了磷酸盐转运蛋白基因OrLPT1,并对其表达进行研究。研究结果如下:1. 利用RT-PCR 方法,从受低磷胁迫（Pi 2.82 μM）处理5 天的水稻（Oryza sativa L.）叶片cDNA 中克隆到一个全长为1605bp 的磷酸盐转运蛋白基因（Genbank accession number:AF335588）,命名为OrLPT1;2. OrLPT1 ORF 编码长为535 个氨基酸（分子量57.6 KDaltons）的蛋白,与其 他植物物种磷酸盐转运蛋白的同源性在64%以上;多肽链的疏水性分析表 明,OrLPT1 具有12 个疏水的跨膜区及高亲和力磷酸盐转运蛋白中保守的3 个磷酸化作用位点:蛋白激酶C作用位点（T-A-R）、N端糖基化部位（N-A-T-T） 和酪蛋白激酶II 作用部位（S-L-E-E）;3. 提取水稻材料基因组,酶切,以OrLPT1 ORF 部分片段（459bp）为探针进行 Southern 杂交分析,结果表明该基因以三个拷贝存在于水稻基因组中,杂交 结果与水稻基因组序列分析完全吻合;4. 采用MEGA 软件（version2.01）自展法对OrLPT1 与其他磷酸盐转运蛋白的 系统进化关系进行分析,OrLPT1 包括在单子叶植物转运蛋白基因组成的大的 分支内,并与OsPT6 的进化关系非常近;5. 在大肠杆菌中进行OrLPT1 的原核表达,并以抗GFP 抗体为一抗作Western blot 检测,结果显示蛋白条带与预计大小一致;6. RT-PCR 方法分析了OrLPT1 器官表达的特异性,低磷（2.82μM）和适磷 （282μM）营养液处理下,叶片中表达都很强;低磷胁迫条件下,根中OrLPT1 的表达显著提高,此表达方式与马铃薯的StPT1 类似;

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1 土壤缺磷现象的普遍存在对水稻育种提出了新要求
• 2 植物对低磷营养胁迫的适应机制
• 2.1 与活化土壤难溶性磷有关的生物学机制
• 2.2 根系对低浓度可溶性磷有效吸收的生物学机制
• 2.3 菌根与土壤磷的活化
• 3 磷酸盐转运蛋白的作用与结构
• 3.1 磷酸盐的获得与转运
• 3.2 磷酸盐转运蛋白的结构
• 3.3 磷酸盐转运蛋白的表达调控
• 3.4 磷酸盐转运蛋白的功能
• 4 原位杂交
• 4.1 RNA 原位杂交的基本原理
• 4.2 RNA 原位杂交的操作流程
• 4.3 RNA 原位杂交在植物基因表达研究中的应用
• 4.4 RNA 原位杂交的应用前景
• 5 研究意义及目的
• 第二章 编码水稻磷酸盐转运蛋白全长基因的克隆
• 1 材料
• 1.1 水稻材料
• 1.2 菌株、质粒
• 1.3 生物试剂
• 2 方法
• 2.1 试验处理与取样
• 2.2 RNA 提取与RT-PCR
• 2.3 PCR 产物回收纯化
• 2.4 PCR 产物的T-A 克隆
• 2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备和热击转化
• 2.6 转化子的验证
• 2.7 测序和序列分析
• 2.8 水稻基因组DNA 提取与Southern blot 分析
• 3 结果与讨论
• 3.1 目的基因的获得与同源性分析
• 3.2 磷酸盐转运蛋白编码基因OrLPT1 的Southern blot 分析
• 3.3 OrLPT1 的系统进化分析
• 第三章 OrLPT1 的原核表达及抗GFP 抗体的Western blot 检测
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株、质粒
• 1.2 方法
• 2 结果与讨论
• 2.1 表达载体的构建
• 2.2 融合蛋白的Western Blot 检测
• 第四章 OrLPT1 的表达调控和特异性研究
• 1 材料
• 1.1 水稻材料
• 1.2 生物试剂
• 2 方法
• 2.1 试验处理与取样
• 2.2 RNA 提取与RT-PCR
• 2.3 Northern blot
• 2.4 原位杂交
• 3 结果与讨论
• 3.1 OrLPT1 表达的器官特异性
• 3.2 OrLPT1 表达的组织细胞特异性
• 3.3 根际营养与OrLPT1 的表达调控
• 第五章 论文小结
• 参考文献
• 附录
• 附录1 本论文所用溶液和缓冲液配方
• 附录2 本论文所用的缩写及中文对照
• 附录3 本论文所用质粒载体图谱及多克隆位点（MCS）
• 硕士期间发表的文章
• 致谢
• 论文独创性声明
• 论文使用授权声明