西瓜花叶病宿州分离物的鉴定

论文摘要

黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus,CMV）是雀麦花叶病毒科（Bromoviridae）黄瓜花叶病毒属（Cucumovirus）的典型成员,是危害茄科、豆科及葫芦科等蔬菜作物的最主要的植物病毒之一,能经75种蚜虫（或由种子）传播,能够侵染85科365属1 000多种植物。CMV为单链、正义RNA病毒,含有RNA1、RNA2、RNA3三条基因组RNA,有些株系还含有卫星RNA。RNA1、RAN2编码与复制酶有关的1a和2a蛋白,RAN2还编码一个与病毒基因表达有关的2b蛋白,RNA3编码运动蛋白和外壳蛋白。 我们从安徽宿州西瓜病叶上分离出一病毒分离物代号为 CMV-As。通过人工接种6 科 20 种植物,其中 6 科 17 种植物发病,在苋色藜和蚕豆上表现枯斑,在葫芦科西瓜、甜瓜、丝瓜等和茄科番茄、辣椒、心叶烟等上表现花叶,在大多数豆科植物上不发病。该分离物汁液钝化温度 55℃～60℃,稀释限点为 10-4～10-5,寄主体外存活期为2～3d。电镜观察病毒粒体为典型球状,直径约20～30nm。A260/A280的比值为0.69,病毒 RNA 含量为 11.3%左右。该分离物与标准 CMV 抗血清及 CMV-As 抗血清呈阳性反应,与健康兔血清、健康植物汁液及 TMV 呈阴性反应。与报道的 CMV 生物学特性极为相似。 经生物学检测初步确定分离物 CMV-As 为黄瓜花叶病毒属的一成员,但由于 CMV可划分为两个亚组即亚组 I 和亚组 II,而两个亚组的生物学特性很相似,所以仅通过生物学检测很难确定分离物 CMV-As 所属种类。为进一步确定分离物的种类,及为今后制备抗血清提供基础,我们进行了分子生物学研究。参考已发表的 CMV 序列（GenBank 登录号 AJ575589）设计引物 Primer1 和 Primer2,并进行 PCR 扩增。RT-PCR反应后获得 657bp 大小的目的片段。将 PCR 产物经 Kpn I、BamH I 双酶切后,定向连接到质粒 pGEM-3Zf（+）中,再转化入大肠杆菌 DH5a 中。以碱法提取质粒,分别以 PCR法和双酶切法筛选阳性重组质粒 pGEM-cp。挑取 3 个阳性克隆进行测序,测序结果完全一致,说明不存在由于 DNA 聚合酶引起的错配碱基,证明得到了准确 CP 基因序列。分析 CP 基因序列并推导氨基酸序列发现:CP 基因全长 657nt,共编码 218 个氨基酸,在 GenBank 随机抽取了 12 个分别代表亚组 I 和亚组 II 的 CMV 分离物,分析发现,CMV-As 与亚组 I 和亚组 II 的 CMV CP 基因的核苷酸序列同源性分别为 91.5%～97.4%和 76.3%～77%,氨基酸序列的同源性分别为 94.4%～98.1%和 76.4%～78.2%,表明分离物CMV-As与CMVI株系较CMVII株系同源关系高,因此分离物CMV-As应隶属于CMVI株系。在随机选取的 12 个 CMV 分离物中,CMV-As 与 GenBank 登录号为 D10538 的 CMV分离物的同源性最高,核苷酸序列同源性为 97.4%,氨基酸序列同源性为 98.1%。 通过 Nde I/BamH I 双酶切从重组质粒 pGEM-cp 上切出 cp 全长基因插入原核表达载体 pET-5a,构建重组原核表达载体 pET-cp。再转化入大肠杆菌 DH5a,以碱法提取质粒,经 Nde I、BamH I 双酶切分析及 PCR 鉴定,挑取阳性克隆再转化入大肠杆菌BL21（DE3）pLysS 中,经 IPTG 诱导培养,SDS-PAGE 检测发现 CMV-CP 基因得到高效表达。CP 基因表达产物将用来制备高效价抗血清,为检测该病毒,同时也为该病毒诊断检测试剂开发奠定基础。 通过以上生物学特性和分子水平的研究可以确定分离物CMV-As为CMV并且隶属于 CMV I

论文目录

• 第一章 文献综述
• 1. 黄瓜花叶病毒的特性
• 1.1 生物学特性
• 1.2 核酸
• 1.3 细胞病理学
• 2. 植物病毒鉴定检测方法的研究进展及CMV 株系鉴定研究进展
• 2.1 植物病毒鉴定检测方法的研究进展
• 2.2 黄瓜花叶病毒的株系鉴定研究进展
• 3. 植物抗病毒基因工程研究现状
• 3.1 病毒来源基因介导的抗性
• 3.2 非病毒基因来源的基因
• 3.3 RNA 介导的抗病毒策略
• 3.4 小结与展望
• 第二章 引言
• 1 本研究的目的及实验设计
• 1.1 本研究的目的及意义
• 2.2 实验设计
• 第三章 分离物 CMV-As 的生物学检测
• 1. 材料
• 2 试验方法
• 3. 结果与分析
• 3.1 寄主反应
• 3.2 体外抗性测定
• 3.3 病毒的提纯、紫外光吸收率和RNA 含量的测定
• 3.4 电镜观察
• 3.5 病毒的血清学检验
• 3.6 蚜虫传毒实验结果
• 4 小结与讨论
• 第四章 分离物 CMV-As CP 基因的克隆与序列分析
• 1. 材料
• 2. 方法
• 3. 结果与分析
• 3.1 分离物CMV-As CP 基因的RT-PCR 扩增
• 3.2 分离物CMV CP 基因的克隆和重组质粒的鉴定
• 3.3 分离物CMV-As CP 基因的序列测定及其分析
• 4. 小结与讨论
• 第五章 CP 基因原核表达及表达产物检测
• 1. 材料
• 2. 方法
• 3. 结果与分析
• 3.1 CP 基因原核表达载体的构建和重组质粒的鉴定
• 3.2 CP 基因的表达及表达产物的SDS-PAGE 分析
• 4 小结与讨论
• 第六章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 附录