论文摘要
背景:胶质瘤是最常见的神经系统原发肿瘤之一,在成人约占到颅内肿瘤的40%～60%,其中占半数以上的胶质母细胞瘤（GBM）患者的中位生存时间为12～15个月,五年生存率不足5%。目前胶质瘤尚无法根治,临床上多采用以手术为主,辅以放疗、化疗等多种方法的综合治疗。化学药物治疗的研究已有多年的历史,在许多肿瘤治疗中取得很好的疗效,但对于胶质瘤,尽管也有许多新药正在开发中,但目前还没有一种药物能取得明显的疗效,因此,寻找新的胶质瘤化疗药物成为人们研究的热点。含砷化合物作为一种抗肿瘤药物在近30年受到人们的重视。我国的临床医生从上世纪70年代开始在临床实践中将三氧化二砷用于治疗白血病,取得了极高的缓解率,90年代在国际上报道后引起了巨大的轰动,人们相继开展了各项研究,迅速促成其在临床上的应用。美国FDA于2000年正式批准三氧化二砷应用于治疗复发性及难治性的急性早幼粒细胞白血病（APL）。雄黄与三氧化二砷同属于砷的化合物,但雄黄的半数致死剂量(LD50)＞10g/kg,而三氧化二砷＜50mg/kg,前者毒性远低于后者,且可以口服,人们纷纷对其抗肿瘤作用和机制展开了许多基础和临床研究。雄黄等砷剂目前主要用于治疗血液系统疾病,应用于其他系统的研究不多,其确切的作用机制目前尚待进一步研究。开展其用于其他疾病的研究,可利于发现雄黄的潜在应用价值,造福于患者。有研究表明,促进细胞凋亡和诱导细胞分化是砷剂抗肿瘤的主要作用方式,可能通过改变细胞的氧化水平、引起线粒体膜损伤、诱导端粒酶活性下降、诱导肿瘤细胞分化和抗血管生成等机制抑制肿瘤生长。本课题拟通过体内外实验观察雄黄对胶质瘤细胞生长的影响,初步探讨雄黄用于胶质瘤治疗的可行性,并对其可能的抗肿瘤机制作初步的研究。目的:采用大鼠C6胶质瘤细胞系作为实验对象,观察雄黄对体外培养的C6胶质瘤细胞生长的作用,探讨雄黄在体外引起肿瘤细胞生长抑制的作用机制;建立C6裸鼠胶质瘤皮下动物模型,通过局部给药的方法,观察雄黄对体内肿瘤的作用并对其机制进行初步探讨。方法:1、C6胶质瘤细胞生长特性的观察①培养条件:大鼠C6胶质瘤细胞培养于含10%胎牛血清、含100U/L青链霉素的高糖DMEM培养基中,置于饱和湿度、37℃、5%CO2的孵箱中。②C6胶质瘤细胞的形态和生长情况的观察:倒置相差显微镜观察C6胶质瘤细胞的形态和生长情况,取对数生长期细胞,消化后以1×105/孔接种于3个六孔板,每个时间点设2个复孔,在接种后2h、4h、6h、8h、10h、12h取出,计算传代后的细胞在各个时间点的贴壁率变化（每孔计数3次,取均值）。③生长曲线的绘制:采用MTT法测定细胞在96孔细胞培养板上的生长情况,以培养时间为横坐标、吸光度值为纵坐标绘制细胞生长曲线;在24孔细胞培养板上采用消化计数取多次平均值的方法测定细胞数目,绘制生长曲线,计算细胞倍增时间。2、雄黄对C6胶质瘤细胞系作用的体外实验①雄黄溶液的制备:按照参考文献配制雄黄溶液,以原子吸收光谱法测定溶液中砷元素的含量以标定药物浓度。②雄黄溶液工作浓度的确定:以MTT法测定雄黄对C6细胞生长的影响,具体步骤如下。取对数生长期的细胞,加入雄黄溶液,调整最终反应浓度分别为5mg/L、10mg/L、25mg/L、50mg/L和100mg/L;以PBS为阴性对照组,与试验孔平行设不加细胞只加培养液的空白对照孔,分别作用24、48小时,上酶标仪检测,以空白对照孔调零,检测570nm处的吸光度;以时间为横轴,光吸收值（A570）为纵轴,绘制细胞生长曲线;以阴性对照组的吸光度为参照,计算细胞存活率及IC50（半数抑制浓度）。根据实验结果,雄黄24小时和48小时的IC50均接近25mg/L,因此,我们选择25mg/L作为雄黄的工作浓度。③超微结构变化的观察:取对数生长期C6细胞,常规消化传代,24小时后加入雄黄溶液,调整浓度至25mg/L。分别作用于C6细胞24小时和48小时后,收集细胞,经戊二醛固定后制作透射电镜标本,在电镜下观察雄黄引起的细胞超微结构变化。④早期凋亡的观察:取对数生长期细胞,传代培养24小时后,加入雄黄溶液调整浓度至25mg/L,分别作用24和48小时后,以Annexin V-FITC-PI双染法标记C6细胞,用流式细胞仪观察其早期凋亡情况。⑤中晚期凋亡的观察:制备细胞爬片,以雄黄溶液分别作用于C6细胞24和48小时后,用TUNEL法标记DNA断端,观察雄黄引起的中晚期凋亡,在光镜下计数阳性细胞,计算细胞凋亡指数。⑥Bax,Bcl-2和c-myc mRNA的表达:雄黄溶液作用C6细胞24和48小时后,收集细胞,常规提取总mRNA,以RT-PCR法检测凋亡相关基因Bax,Bcl-2和癌基因c-myc mRNA的表达情况。⑦Bax,Bcl-2和c-myc蛋白的表达:雄黄溶液作用于C6细胞24和48小时,常规提取总蛋白,以免疫印迹法（Western Blotting）检测Bax,Bcl-2和c-myc蛋白的表达情况。⑧细胞增殖活性检测:制备细胞爬片,应用免疫组织化学方法对雄黄溶液作用24和48小时后的C6胶质瘤细胞进行PCNA标记,观察细胞的增殖活性变化。3、雄黄抗C6胶质瘤的体内实验①动物模型的建立和观察:抽取含105个C6单细胞悬液接种于裸鼠臀部皮下,建立C6/Balb/c裸小鼠皮下胶质瘤动物模型,每天测量肿瘤直径,观察肿瘤的生长情况,待肿瘤直径达5mm时分组进入实验。②药物干预:裸鼠随机分为无干预组、PBS阴性对照组和雄黄治疗组。建模成功后,无干预组正常饲养,不予其他任何处理;PBS对照组和雄黄治疗组采用局部注射的方法,分别将PBS和雄黄一次性注入动物瘤体内,观察记录肿瘤生长情况,绘制肿瘤生长曲线。治疗后第11天处死动物,取肿瘤组织行进一步实验。③肿瘤组织的鉴定:使用免疫组化法对所得组织进行GFAP染色,检测GFAP表达情况,确定其肿瘤胶质细胞来源。④形态学观察:通过HE染色观察肿瘤组织的显微结构变化,电镜下观察实验各组的肿瘤细胞超微结构变化。⑤用TUNEL法检测细胞凋亡情况:对照组和雄黄处理组肿瘤组织的石蜡切片经常规处理后按照TUNEL试剂盒说明书进行标记、染色,光镜下计数阳性细胞,计算凋亡指数。⑥肿瘤组织的Bcl-2、Bax和c-myc mRNA和蛋白表达情况的观察:分别使用RT-PCR法和Western Blotting法检测PBS组和雄黄治疗组肿瘤组织Bcl-2、Bax和c-myc mRNA和蛋白表达情况。4、统计分析:使用SPSS for Windows 11.5进行统计分析。所有计量资料均以“（?）±s”的形式表示,根据实验结果的情况（样本数量、方差齐性、正态性检验）选择适当的检验方法（t检验、方差分析或非参数检验）;计数资料的比较采用率的比较。结果:1、C6胶质瘤细胞的生长特性观察:①我们所获得C6胶质瘤细胞具备生长稳定的特点,在一定培养阶段能够呈对数期生长。倒置显微镜下观察发现,细胞贴壁生长,呈梭形或三角形,大小均匀,排列紧密,折光性强,细胞膜光滑无突起,细胞核呈圆形,居中,核仁不明显,细胞增殖活跃,核分裂相多见。2h、4h、6h、8h、10h、12h时的贴壁率分别为22%,70%,85%,87%,92%,97%,符合实验要求。②以MTT法测定的细胞生长曲线,显示按照4×103/孔的浓度种植于96孔板、2×104/孔种植于24孔板均可获得自接种24小时后开始连续3天的对数生长期,可以满足实验的要求。2、雄黄抗C6胶质瘤的体外实验结果①所配制的雄黄原溶液经原子吸收光谱法测定砷浓度为1034mg/L。②按MTT结果显示,各浓度的雄黄作用于C6细胞24、48小时后的抑制率与阴性对照组比较均有统计学差异（P＜0.05）;作用24小时,临近浓度组间（5mg/L与10mg/L组间,10mg/L、25mg/L和50mg/L组间）的抑制率经组内两两比较比较没有发现显著性差异。而在48小时时,各浓度之间的抑制率差别增加,相邻浓度组间差别有统计学意义。100mg/L组与其他各浓度组均有显著性差异（P＜0.05）。曲线作图后根据公式计算得24小时和48小时的IC50分别为28mg/L、26mg/L（图1-7）。③电镜下观察到发现,对照组细胞呈椭圆形,表面微绒毛正常,染色质在胞核内分布均匀,粗面内质网增生活跃;在雄黄作用24小时组可发现细胞凋亡变化,如核固缩、染色质趋边凝聚等;作用48小时可发现除上述改变外,少数细胞出现坏死改变。④Annexin V-FITC-PI双染流式细胞仪检测发现,雄黄作用于C6细胞可发现凋亡特征,24小时和48小时的凋亡率分别为10.13±3.14%和41.04±17.44%,二者比较有显著性差异。⑤TUNEL结果显示,雄黄作用24、48小时细胞的阳性率分别为8.7±1.83%和12.2±5.75%,二者比较有显著性差异。⑥RT-PCR结果:与对照组比较,雄黄溶液作用24小时后,c-myc和Bcl-2 mRNA表达受抑,Bax mRNA的表达水平升高,在作用48小时更明显,以上结果均有显著性差异（P＜0.05）。⑦Western Blotting结果:与对照组相比,雄黄作用于C6细胞24小时能使Bcl-2和c-myc蛋白表达降低,并促进Bax蛋白表达水平,其作用在48小时更加明显（P＜0.05）。⑧PCNA免疫组织化学染色发现25mg/L的雄黄作用24和48小时的PCNA指数分别为76.6±11.2%和81.2±12.1%,与对照组比较无统计学差异。3、雄黄抗C6胶质瘤的体内实验结果①成瘤情况:所有小鼠均在种植细胞后4-5天接种局部形成肿块,成瘤率100%,肿瘤随时间而增大,肿瘤形成的潜伏期为4天左右。②体内实验中发现,雄黄治疗组的Balb/c裸小鼠肿瘤从治疗后第3天开始,组间肿瘤体积比较出现显著性差异（P=0.007）,进一步两两比较示雄黄治疗组与无干预组和PBS阴性对照组均有显著性差异（P＜0.01）,观察发现,随实验进展雄黄治疗组与其他两组间的差异趋于明显。③肿瘤组织来源鉴定:免疫组织化学染色示GPFA表达均为阳性,确认皮下肿瘤组织为胶质细胞瘤。④形态学观察:光学显微镜下见雄黄治疗组的肿瘤细胞排列较无干预组和PBS对照组稀疏,部分组织有明显的坏死。电镜下见空白对照组肿瘤细胞内细胞器丰富,核内染色质分布均匀,可见核仁,核周胞质丝清晰,未查见凋亡小体;雄黄治疗组可多见凋亡细胞,核内染色质趋边凝聚明显,排列于核膜内侧。⑤TUNEL结果:空白对照组、PBS对照组和雄黄治疗组的凋亡指数分别为1.62±0.21、1.76±0.33和5.17±0.42。雄黄治疗组与前两者相比较有显著性差异（P＜0.05）.。⑥Bax、Bcl-2和c-myc mRNA和蛋白的表达:雄黄治疗组与无干预组和PBS处理组比较,其肿瘤组织Bcl-2和c-myc mRNA和蛋白表达水平较低,Bax mRNA和蛋白表达较高,且有统计学意义（P＜0.05）。4、结论①本实验表明,雄黄对胶质瘤C6细胞有抑制作用,且具有浓度和时间依赖性。雄黄均可在体内外引起C6胶质瘤细胞生长抑制,其机制与细胞增殖活性无关。②初步的形态学观察和凋亡检测表明雄黄引起的肿瘤细胞生长抑制可能与细胞凋亡有关;雄黄诱导C6细胞凋亡发生的机制可能与上调凋亡相关基因Bax以及下调癌基因c-myc和抗凋亡基因Bcl-2的表达有关。