基于量子点的荧光免疫分析在几种农兽药残留检测中的应用研究

论文摘要

量子点（QDs）是近年发展起来的一种新型荧光纳米材料,与传统有机荧光染料相比,具有许多优良的荧光性能,在生物分析化学、荧光免疫学、基因组学、蛋白质组学和细胞生物学等领域显示出广阔的应用前景,已经引起人们的广泛关注。本论文在简要综述量子点技术发展的基础上,以量子点制备、纯化、性能表征及在农药和兽药残留检测中应用为主线,主要开展以下几个方面工作。一、基于量子点和羊抗小鼠二抗的偶联物,建立一种灵敏、快速检测饮用水中毒死蜱的荧光免疫分析法（cFLISA）。基于量子点和二抗偶联物的荧光免疫分析法（cFLISA）中的线性检测范围为15.2-205.5ng mL-1,灵敏度（IC50）为50.2ng mL-1,检出限（LOD）为8.2ng mL-1。荧光免疫分析法（cFLISA）与传统酶联免疫分析法（ELISA）相比,不仅灵敏度提高1.5倍,检测时间也缩短0.5h。在实际水样检测中,荧光免疫分析法（cFLISA）的检测结果与酶联免疫分析法（ELISA）、高效液相色谱方法（HPLC）的检测结果相符,表明该方法可用于环境和食品中农药残留的检测和大规模样品筛查。二、利用水相法合成碲化镉量子点,并制备相应量子点-链霉亲和素荧光探针（QDs-SA）,建立基于QDs-SA偶联物的新型荧光免疫分析方法（QDs-SA-cFLISA）并应用于毒死蜱的检测。采用水相合成法,以巯基丙酸为稳定剂,制备表面带羧基的水溶性碲化镉量子点（CdTe QDs）;其激发光谱宽且连续,发射光谱比较窄而对称,粒径比较均一荧光性质稳定,具有良好的光学性能。将表面带羧基的水溶性碲化镉量子点（CdTe QDs）和链霉亲和素（SA）偶联,制备量子点-链霉亲和素荧光探针（QDs-SA）,作为信号系统和信号放大系统,建立新型的荧光免疫分析方法（QDs-SA-cFLISA）。荧光免疫分析方法（QDs-SA-cFLISA）与常规酶联免疫分析法（ELISA）相比,量子点-链霉亲和素荧光探针（QDs-SA）取代常规酶联免疫分析法（ELISA）中的酶标抗体,灵敏度提高5.5倍,检测时间缩短1h。在实际水样检测中,荧光免疫分析方法（QDs-SA-cFLISA）的检测结果与酶联免疫分析法(ELISA、高效液相色谱方法（HPLC）的检测结果相符,表明该方法可用于饮用水中毒死蜱残留的检测。三、小分子直接包被技术和量子点（QDs）纳米材料相结合,建立灵敏、快速的免疫分析方法并用于虾仁中氯霉素的检测。酶标板表面用戊二醛（GA）处理,引入醛基与氨基化氯霉素直接偶联,将氯霉素小分子直接包被在酶标板上,并结合生物素化一抗和量子点-链霉亲和素荧光探针（QDs-SA）,建立基于小分子半抗原直接包被方式和量子点（QDs）荧光探针结合的新型荧光免疫分析方法（QDs-SA-direct Hap coated cFLISA）。荧光免疫分析方法（QDs-SA-direct Hap coated cFLISA）的直接包被模式与传统酶联免疫分析法（ELISA）的完全抗原包被模式相比,抗原-抗体结合效率高且稳定性强,不仅灵敏度提高5倍,检测时间也缩短1h。在实际样品虾仁检测中,荧光免疫分析方法（QDs-SA-direct Hap coated cFLISA）的检测结果与酶联免疫分析法(ELISA、高效液相色谱方法（HPLC）的检测结果相吻合,表明该方法可作为传统酶联免疫分析法（ELISA）重要的补充,也用于食品和环境中兽药残留的检测。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1 量子点的基本特性
• 2 量子点的制备方法
• 2.1 有机体系中合成量子点
• 2.2 水相法合成量子点
• 2.3 生物合成方法
• 3 表面修饰
• 4 量子点在分析科学中的研究进展
• 4.1 量子点在无机离子和小分子测定中的应用
• 4.2 量子点在生物大分子测定中的应用
• 4.3 量子点在免疫分析中的应用
• 5 问题与展望
• 6 本论文的研究意义和创新点
• 第二章 基于量子点-羊抗小鼠二抗偶联物的荧光免疫分析方法的建立
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 试剂
• 2.1.2 仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 基于量子点cFLISA方法和常规ELISA法的步骤
• 2.2.2 抗原和抗体浓度的优化
• 2浓度的优化'>2.2.3 QDs-Ab₂浓度的优化
• 2.2.4 加标回收率和精密度
• 2.2.5 实际水样的检测
• 3 结果与讨论
• 3.1 cFLISA方法灵敏度条件的优化
• 3.1.1 一抗和包被抗原浓度的优化
• 3.1.2 量子点-二抗溶液浓度的优化
• 3.2 cFLISA方法学的评价
• 3.2.1 灵敏度
• 3.2.2 特异性
• 3.2.3 精密度和准确性
• 3.3 实际水样的检测
• 4 结论
• 第三章 量子点-链霉亲和素偶联物的制备及其在毒死蜱残留检测中的应用
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 主要试剂
• 2.1.2 主要仪器设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 水相法合成水溶性CdTe量子点
• 2.2.2 量子点光谱性质的鉴定
• 2.2.3 QDs-SA偶联物的制备及纯化
• 1）'>2.2.4 制备生物素化一抗（Biotinylated-Ab₁）
• 2.2.5 QDs-SA-cFLISA方法
• 2.2.6 传统ELISA步骤
• 2.2.7 交叉反应率（CR）
• 2.2.8 生物素化一抗和包被抗原浓度的优化
• 2.2.9 QDs/SA的合适摩尔比
• 2.2.10 QDs和SA偶联反应中的最佳pH值
• 2.2.11 QDs-SA偶联物最佳的稀释比例
• 2.2.12 HPLC方法
• 2.2.13 加标回收
• 2.2.14 饮用水实际样品的检测
• 3 结果与讨论
• 3.1 量子点的荧光性质
• 3.2 QDs-SA-cFLISA方法的优化
• 3.2.1 最佳的生物素化一抗和包被抗原
• 3.2.2 QDs/SA的偶联比
• 3.2.3 QDs和SA偶联反应过程中pH的优化
• 3.2.4 最佳的QDs-SA偶联物稀释比
• 3.3 方法的灵敏度
• 3.4 特异性
• 3.5 准确度和精密度
• 3.6 实际水样的检测
• 3.7 传统ELISA和QDs-SA-cFLISA方法的比较
• 4 总结
• 第四章 基于小分子半抗原直接包被模式和量子点荧光探针的荧光免疫分析方法的建立
• 1 前言
• 2 实验材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 主要的仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 制备完全抗原偶联物（CAP-BSA）
• 2.2.2 合成amino-CAP
• 2.2.3 制备biotinylated mAb
• 2.2.4 基于QDs-SA偶联物和小分子直接包被方式的QDs-SA-Hap coatedcFLISA步骤
• 2.2.5 传统ELISA方法
• 2.2.6 竞争抑制免疫分析方法的建立
• 2.2.7 GA浓度、小分子半抗原包被浓度和封闭液种类的优化
• 2.2.8 优化biotinylated-mAb和QDs-SA偶联物的浓度
• 2.2.9 交叉反应率（CR）
• 2.2.10 虾仁中氯霉素的提取和含量分析
• 2.2.11 加标回收率和精密度分析
• 2.2.12 高效液相色谱分析方法
• 3 结果与讨论
• 3.1 CAP-BSA完全抗原的合成和amino-CAP的鉴定
• 3.2 方法灵敏度的优化
• 3.2.1 最佳的GA和包被抗原Hap的浓度
• 3.2.2 最佳biotinylated mAb浓度和最优QDs-SA偶联物稀释比
• 3.2.3 包被条件和封闭条件的优化
• 3.3 方法的评估
• 3.3.1 方法的灵敏度
• 3.3.2 方法的特异性
• 3.3.3 加标回收率和准确率
• 3.3.4 实际样品的分析
• 4 结论
• 第五章 全文总结的展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录