论文摘要
牛结核病（bovine tuberculosis，bTB）是主要由牛型分枝杆菌（Mycobacterium bovis）感染引起的一种慢性消耗性人兽共患传染病，其中奶牛为最易感动物。伴随我国奶业的快速发展，我国奶牛结核病近年来蔓延全国，不仅阻碍着我国奶业的可持续发展，而且严重威胁食品安全和公共卫生。1．牛型分枝杆菌cfp10-esat-6融合基因的克隆及表达应用PCR方法从牛分枝杆菌临床分离株基因组中扩增获得cfp-10和esat-6四个目的基因片段，通过引入一段Linker序列构建cfp10-esat-6融合基因；并且克隆入表达质粒pET-28a（+）。经测序确认，转化大肠杆菌BL21，经IPTG诱导，成功表达了具有良好抗原性的CFP10-ESAT-6融合蛋白。2．牛型分枝杆菌MPB70-MPB83-CFP10-ESAT-6融合蛋白的表达应用PCR方法从牛型分枝杆菌临床分离株基因组中扩增获得mpb70、mpb83、cfp10和esat-6四个目的基因片段，测序鉴定序列的正确性。采用重叠延伸剪接技术（splicing by overlap extension，SOE）获得融合基因cfp10-esat-6和mpb83-cfp10-esat-6，将mpb70和mpb83-cfp10-esat-6串连于载体pUC19-Link上，再将mpb70-mpb83-cfp10-esat-6连于表达载体pET28a（+）中得到重组质粒pET-28a-MPB70-MPB83-CFP10-ESAT-6。转化BL21（DE3）大肠杆菌感受态细胞，经IPTG诱导获得可溶性表达的融合蛋白。用Ni++亲合层析柱纯化该融合蛋白。ELISA及Western blot鉴定融合蛋白的免疫活性，热处理法分析蛋白的热稳定性。经ELISA验证该融合蛋白能分别与抗原蛋白MPB70、MPB83和CFP10-ESAT-6的多抗反应，说明该融合蛋白具有单个抗原的免疫学活性。Western blot分析显示，该融合蛋白能与抗牛型分枝杆菌阳性血清发生特异性反应，而与其它非相关抗原的阳性参考血清如牛副结核病、牛布氏杆菌病、牛巴贝斯病和牛传染性鼻气管炎病阳性血清等不反应。热稳定性试验证明该融合蛋白为一种热稳定性好的蛋白。通过基因工程融合表达了牛型分枝杆菌的四种特异性抗原蛋白，该蛋白具有单个蛋白的免疫原性和稳定性，作为一种新型的诊断抗原具有良好的应用前景。3．牛结核病ELISA抗体检测方法的临床应用大肠杆菌原核表达MPB70-MPB83-CFP10-ESAT-6融合抗原，进行纯化与鉴定后，以此为诊断抗原建立了牛结核病间接ELISA抗体检测（iEHSA）的诊断方法。数据结果用血清样本与阳性对照和阴性对照的OD630相对值（S／P）表示，用90份健康牛血清检测结果确定阴阳性临界值S／P为0.17。iELISA与常见非相关牛病的参考阳性血清无交叉反应。以结核菌素皮肤试验（TST）为参考方法，检测了华中地区四个奶牛场的560头黑白花奶牛。在所检测的560份血清中，iELISA阳性105份，阴性455份；TST阳性76份，阴性484份；两种方法共同检出阳性样本55份，共同检出阴性样本434份，总符合率为87.32％。以TST为金标准，则iELISA的敏感性为72.37％（55／76），特异性为89.67％（434／484）。另外，又用iELISA、胶体金试纸条（CGST）和细菌培养平行检测了其中150头黑白花奶牛。iELISA与CGST的符合率为93.33％（140／150），采集其中22头奶牛鼻拭子分菌培养，iELISA与细菌培养的符合率为77.27％（17／22）。对这22头皮试阳性牛进行跟踪检测，第一次检测抗体阳性率为36％（8／22），7个月后再次采样，22头阳性牛中有6头已被淘汰，其余16头抗体检测均为阳性，检出率为100％（16／16），表明牛型分枝菌感染诱导的体液免疫反应滞后于细胞免疫反应。检测来自湖北武汉地区和宜昌地区共计1014份血清样品，其中阳性167份，阴性血清847份，总体阳性率为16.47％。不同牛场间阳性率差异很大，从0％～65％不等。总体上小型养殖场（＜100头）阳性率较高，部分奶牛场结核污染严重；大型养殖场阳性率较低。进一步检测了来自于中国30个省市的1344份奶牛血清，结果表明牛型分枝杆菌血清抗体阳性率平均为1.60％，范围从0％-20％，表明牛型分枝菌感染呈现地方流行性趋势。