高效农药残留物检测酶纳米生物传感器的研制

论文摘要

长期使用农药引起农产品中农药残留超标,对生态环境和人类健康造成极大危害。有机磷和氨基甲酸酯类农药是最常见的两类农药,也是目前为止仍然最广泛使用的农药,它们是一种神经毒物,会抑制人及动物体内胆碱酯酶活性,引起中枢神经系统功能紊乱,出现中毒症状,以至危及生命。近年来,农药残留问题已经受到了世界范围的关注。随着人们食品安全意识的不断增强,改善农药残留检测技术已迫在眉睫。农药残留常用的检测方法为气相、液相色谱法、质谱法以及波谱法等,通常耗时长、成本高,难以满足现场快速检测的需要。因此,急需研究一些快速、灵敏、便捷的检测方法,将高农药残留的农产品阻挡在市场之外,以杜绝食品安全事故的发生。生物传感分析技术与传统方法相比具有选择性好、灵敏度高、分析速度快、成本低、能在线检测等优点,在环境监测、食品检验等方面得到高度重视和广泛应用。乙酰胆碱酯酶（AChE）生物传感器广泛应用于有机磷和氨基甲酸酯类农药的测定。由于乙酰胆碱酯酶能够选择性的催化底物水解,且其催化活性能被有机磷农药所抑制,利用这一特性可制成用于测定有机磷农药含量生物传感器。为了提高传感器的灵敏度,通常在制备传感器时,在基础电极上修饰某种电化学催化剂,以增强传感器对底物的响应信号。纳米材料具有独特的物理和化学特性,能促进生物分子的活性中心与电极间的直接电子交换,同时最大限度地保持生物分子的活性。因此,将纳米技术应用于生物分子电化学分析研究,有利于创新性地建立一些新理论、新技术和新方法,将是一个很有前景的领域。本文旨在建立快速检测果蔬中有机磷和氨基甲酸酯农药残留的电化学酶生物传感器。试验以玻碳电极作为信号转换器,分别利用纳米氧化锌和纳米氧化硅以及多壁碳纳米管作为电极修饰材料,构建新型生物传感器,并对其电化学性质进行研究。主要研究结果如下：（1）实验中对粗酶液的提取条件进行了研究。采用了Sephadex G-200层析,对鞘翅目昆虫洋虫的头胸部组织粗酶提取液中的乙酰胆碱酯酶进行了分离纯化,并对纯化后的酶液的性质进行了研究。结果表明,洋虫头胸部乙酰胆碱酯酶粗酶的最适提取条件为：pH7.5,Triton X-100浓度为2.0%,按料液比为1：5,4℃下浸提10个小时。采用Sephadex G-200层析纯化粗酶液,AChE的纯化倍数为52.76倍,总蛋白含量2.37 mg,酶比活力达到13.19 OD/（min/mg）,酶活回收率为85.67%。纯化后的样品经SDS-PAGE电泳测定其分子量为78.6 KDa。通过纯化后的酶性质研究,确定检测条件为：最佳反应温度为36℃时,抑制时间为35 min。通过敌敌畏抑制试验检测酶的特性,结果表明,敌敌畏在0.2-2μM范围内,AChE抑制率与农药浓度呈良好的线性关系,抑制率等式为I%=（18.38c+11.25）%。当敌敌畏在2-10μM范围内,AChE抑制率与农药浓度呈另一线性关系,抑制率等式为I%=（1.53c+51.66）%。检出限为1.58±0.37μg/L。（2）采用薄膜蒸发-冻融法制备AChE脂质体,通过正交设计优化制备工艺,以鱼精蛋白沉淀法分离脂质体与游离酶。通过计算活性包封率,确定AChE脂质体最佳制备工艺为：根据正交试验结果,确定最佳处方工艺,即卵磷脂与胆固醇的质量比为2：1,（卵磷脂+胆固醇）的质量与AChE的质量之比1：2,冻融时的循环次数为30次,旋转速度为150 rpm,最佳处方工艺制得的5组脂质体的活性包封率的平均值为89.5%。AChE脂质体生物反应器有效平均粒径为7.3±0.85μm,其中85%（体系分数）的生物反应器微粒集中在7μm。AChE脂质体生物反应器表面电势-78.6 mV。AChE脂质体生物反应器相比于同等酶含量的游离酶,具有较高的稳定性。Porin蛋白嵌入磷脂层,构成底物进入通道的同时控制酶的逸出,因为酶的大小无法通过孔道。脂质体内酶的活性根据荧光指示剂的信号强度来测定。通过敌敌畏和西维因抑制试验结果表明,AChE抑制率与农药浓度呈良好的线性关系,检出限分别为1.134±0.29μg/L和1.364±0.35μg/L。（3）采用三电极系统对玻碳电极进行了预处理及活化,实验结果表明,GCE-（CS/ALB）n对底物ATChCl的催化电流值随着组装层数的增多而明显增大,（CS/ALB）多层膜最适层数为5层,（CS/ALB）5同时体现出了较好的稳定性。抑制率与敌敌畏的浓度在一定范围内存在线性关系。在0.25-1.5μM的范围内抑制率回归方程为I%=（24.45c+12.35）%,相关系数R2为0.9981。在1.75-10μM的范围内抑制率回归方程为I%=（1.86c+58.76）%,相关系数R2为0.9914。检出限为0.86±0.098μg/L。（4）采用硅酸钠为硅源,氯化铵为沉淀剂制备纳米二氧化硅。研究了硅酸钠的浓度、乙醇与水的体积比以及pH值对纳米二氧化硅粉末比表面积的影响。利用XRD衍射和扫描电子显微镜对产物进行表征。选用最适体系制备出的纳米氧化硅比表面积平均值为297.3 m2/g,表面电势为-42.5 mV,平均粒径为115.5±1.86 nm。（ALB/SiO2）n最适层数为6。GCE-（ALB/SiO2）6对农药的响应实验结果表明,该电极灵敏度较高且抑制率与农药的浓度在一定范围内存在线性关系。GCE-（ALB/SiO2）6具有较好的重复性和稳定性。（5）将多壁碳纳米管（MWNTs）置于混酸（硝酸：硫酸=1：3）中,利用超声波振荡截短碳纳米管、并使其与羧基链接,而后基于阳离子聚合电解质壳聚糖（CS）和带有阴离子的碳纳米管之间的静电作用,通过层层自组装的模式均匀稳定地形成复合壳聚糖多层膜。GCE-（ALB/MWNTs）n最适层数为6层。在GCE-（ALB/MWNTs）6对农药的响应实验结果表明,农药抑制率与农药的浓度在一定范围内存在线性关系,检出限为0.68±0.076μg/L。（6）采用溶胶-凝胶法制备Al掺杂的ZnO纳米粉体。结合正交设计对各因素进行优化,得到最适制备条件为：醋酸锌浓度为1.5 mol/L,(（NH）3C6H5O7浓度为2 mol/L,Al掺杂质量分数1.5%,V（乙醇）：V（H2O）为1.5：1和煅烧温度1200℃。XRD分析和EDS能谱分析表明Al元素已经融合进了ZnO的晶格当中。GCE-（ALB/ZnO）n最适层数为5层。GCE-（ALB/ZnO）5对展现了良好的光电性能,当紫外光与可见光同时存在时,经Al-ZnO修饰的电极具有较高的响应电流。农药抑制率与农药的浓度在一定范围内存在线性关系,检出限为0.76±0.087μg/L（7）将纳米ZnO、MWNTs和纳米氧化硅这三种纳米材料,经过有序的组合构建酶最终获得了以（ALB/MWNTs/SiO2/ZnO）4膜为基础的性能优越的电化学生物传感器。根据新型传感器的性能优化工作条件,即反应体系总体积10 mL,底物反应时间15 min,体系温度36℃,同时伴随光源辐射,反应体系pH值为7.4,农药样品抑制12 min,加入1.25 mM底物,反应15 min。在敌敌畏响应实验中,农药抑制率与农药的浓度在一定范围内存在线性关系,检出限为0.53±0.096μg/L。（8）实验中考察了新型传感器的抗干扰能力和可再生能力,这两方面的特性直接影响着传感器的实际应用。在研究重金属离子、农药以及其他化合物对AChE生物传感器测定时的影响过程中,发现酶纳米复合结构生物传感器在含有重金属离子和不同农药的溶液中基本不受影响,含有抗坏血酸的体系对传感器的影响较大。筛选出三种物质来活化酶传感器可再生的活化物。通过比较选择碘解磷定（2-PAM）作为传感器可再生的活化物。结果表明,所制备的传感器可以重复使用6次,活性仍在80%以上。（9）采用优化好的体系制备酶纳米生物传感器,测定对两类中的8种农药的电化学响应,结果表明8种农药抑制率分别在一定范围内与农药浓度呈良好的线性关系,且具有较低的检出限。利用乙酰胆碱酯酶生物传感器技术,以苹果、小白菜和黄瓜为样品,采用标准加入法进行分析,测定蔬菜水果中有机磷和氨基甲酸酯类农药的残留。酶纳米传感器检测三种果蔬中两类农药残留时,均表现出良好的精确度、重现性和准确性,可以用于实际的检测,且不需要繁琐的样品预处理过程,能够满足快速检测的需要。

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摘要

Abstract

1 绪论

1.1 引言

1.2 农药的作用及其残留危害

1.3 农药检测方法的应用进展

1.3.1 光谱法检测农药残留

1.3.2 气相色谱与气质联用法检测农药残留

1.3.3 高效液相色谱与液质联用法检测农药残留

1.3.4 免疫法检测农药残留

1.3.5 分子印迹杂交技术检测农药残留

1.3.6 生物芯片技术检测农药残留

1.3.7 生物传感器法检测农药残留

1.4 生物传感器的研究进展

1.4.1 生物传感器的应用

1.4.2 基于化学修饰电极的生物传感器

1.4.3 酶生物传感器的应用

1.4.4 胆碱酯酶生物传感器的研究进展

1.4.5 酶生物传感器中生物组分的固定方法

1.5 纳米材料的催化性能及其在生物传感器方面的应用

1.5.1 纳米材料的性质特点

1.5.2 纳米材料的合成与制备

1.5.3 纳米生物传感器的概述

1.5.4 纳米氧化锌的特性及其在生物传感器方面的应用

1.5.5 纳米氧化硅的特性及其在生物传感器方面的应用

1.5.6 碳纳米管的特性及其在生物传感器方面的应用

1.6 脂质体的制备及其在生物传感器中的应用

1.6.1 脂质体的制备技术

1.6.2 脂质体在生物传感技术中的应用

1.7 乙酰胆碱酯酶的获得

1.7.1 酶源的选择

1.7.2 昆虫体内AChE的分布

1.7.3 乙酰胆碱酯酶的分离纯化

1.8 本文的研究目的、意义及主要内容

2 农药靶标乙酰胆碱酯酶的提取纯化及其性质研究

2.1 材料和方法

2.1.1 供试虫源

2.1.2 药品试剂及仪器设备

2.1.3 洋虫头胸部乙酰胆碱酯酶粗酶液提取条件的研究

2.1.4 洋虫头胸部乙酰胆碱酯酶的分离纯化

2.1.5 洋虫头胸部乙酰胆碱酯酶的SDS-PAGE分析

2.1.6 农药对洋虫头胸部乙酰胆碱酯酶抑制率影响条件的研究

2.1.7 洋虫头胸部乙酰胆碱酯酶对农药检测灵敏度的研究

2.2 结果与分析

2.2.1 洋虫头胸部乙酰胆碱酯酶提取工艺条件的选择

2.2.2 洋虫头胸部乙酰胆碱酯酶的纯化分析

2.2.3 农药对纯化后AChE抑制率影响条件的测定

2.2.4 纯化后AChE对农药检测灵敏度的研究

2.3 本章小结

3 基于脂质体微粒的酶生物反应器的制备与性能研究

3.1 材料和方法

3.1.1 主要药品试剂

3.1.2 仪器设备

3.1.3 乙酰胆碱酯酶脂质体制备工艺的研究

3.1.4 农药残留检测AChE生物反应器的构建与表征

3.1.5 AChE生物反应器的贮存稳定性研究

3.1.6 AChE生物反应器与底物的反应研究

3.1.7 AChE生物反应器检测样品中农药残留的研究

3.2 结果与分析

3.2.1 AChE脂质体的制备工艺条件的选择

3.2.2 AChE生物反应器的表征

3.2.3 AChE生物反应器的稳定性研究

3.2.4 荧光检测AChE生物反应器的反应活性

3.2.5 AChE生物反应器检测样品中的农药残留

3.3 本章小结

4 AChE生物反应器修饰玻碳电极对底物的电化学测定

4.1 材料和方法

4.1.1 主要药品试剂

4.1.2 仪器设备

4.1.3 电化学检测装置

4.1.4 玻碳电极的预处理

4.1.5 制备AChE生物反应器修饰的玻碳电极及其酶固定量测定

4.1.6 AChE生物反应器修饰玻碳电极对底物的电化学测定

n多层膜的表征及GCE-（CS/ALB）_n稳定性研究'>4.1.7 （CS/ALB）_n多层膜的表征及GCE-（CS/ALB）_n稳定性研究

4.1.8 电化学检测农药对AChE生物反应器的抑制作用

4.2 结果与分析

4.2.1 玻碳电极的抛光与活化

4.2.2 不同层数的（CS/ALB）对输出电流的峰值的影响

5的表征与GCE-（CS/ALB）₅的工作稳定性研究'>4.2.3 （CS/ALB）₅的表征与GCE-（CS/ALB）₅的工作稳定性研究

5的电化学行为研究'>4.2.4 GCE-（CS/ALB）₅的电化学行为研究

5对农药的响应'>4.2.5 GCE-（CS/ALB）₅对农药的响应

4.3 本章小结

5 纳米氧化硅修饰酶电极的制备及其性能研究

5.1 材料和方法

5.1.1 主要药品试剂

5.1.2 仪器设备

5.1.3 超声波-沉淀法制备纳米氧化硅

5.1.4 纳米氧化硅的表征

5.1.5 基于静电吸附-电沉积法制备AChE生物反应器多层膜

2）_n多层膜的表征及GCE-（ALB/SiO₂）_n稳定性研究'>5.1.6 （ALB/SiO₂）_n多层膜的表征及GCE-（ALB/SiO₂）_n稳定性研究

5.1.7 酶多层膜修饰玻碳电极对底物的电化学测定

5.1.8 电化学检测农药对AChE生物反应器的抑制作用

5.2 结果与分析

5.2.1 纳米氧化硅的制备与表征

2）酶膜'>5.2.2 基于电流响应特性筛选不同吸附层数的（ALB/SiO₂）酶膜

2）₆的表征与GCE-（ALB/SiO₂）₆的工作稳定性研究'>5.2.3 （ALB/SiO₂）₆的表征与GCE-（ALB/SiO₂）₆的工作稳定性研究

2）₆的电化学行为研究'>5.2.4 GCE-（ALB/SiO₂）₆的电化学行为研究

2）₆对农药的响应'>5.2.5 GCE-（ALB/SiO₂）₆对农药的响应

5.3 本章小结

6 多壁碳纳米管修饰酶电极的制备及其性能研究

6.1 材料和方法

6.1.1 主要药品试剂

6.1.2 仪器设备

6.1.3 多壁纳米碳管的羧基化修饰及表征

6.1.4 MWNTs多层膜修饰电极的制备

n多层膜的表征及GCE-（ALB/MWNTs）_n稳定性研究'>6.1.5 （ALB/MWNTs）_n多层膜的表征及GCE-（ALB/MWNTs）_n稳定性研究

6.1.6 酶多层膜修饰玻碳电极对底物的电化学测定

6.1.7 电化学检测农药对AChE生物反应器的抑制作用

6.2 结果与分析

6.2.1 修饰前后MWNTs的表征

6.2.2 基于电流响应特性筛选不同吸附层数的（ALB/MWNTs）酶膜

6的表征与GCE-（ALB/MWNTs）₆的工作稳定性研究'>6.2.3 （ALB/MWNTs）₆的表征与GCE-（ALB/MWNTs）₆的工作稳定性研究

6的电化学行为研究'>6.2.4 GCE-（ALB/MWNTs）₆的电化学行为研究

6对农药的响应'>6.2.5 GCE-（ALB/MWNTs）₆对农药的响应

6.3 本章小结

7 功能性氧化锌修饰酶电极的制备及其性能研究

7.1 材料和方法

7.1.1 主要药品试剂

7.1.2 仪器设备

7.1.3 Al掺杂纳米氧化锌的制备与表征

7.1.3.1 基础制备方法

7.1.3.2 正交优化制备工艺

7.1.3.3 修饰后颗粒的表征

7.1.4 制备AChE生物反应器/纳米氧化锌玻碳电极

n多层膜的表征及GCE-（ALB/ZnO）_n稳定性研究'>7.1.5 （ALB/ZnO）_n多层膜的表征及GCE-（ALB/ZnO）_n稳定性研究

7.1.6 修饰电极的光电化学性能测试

7.1.7 修饰电极对底物的电化学行为

7.1.8 电化学检测农药对AChE生物反应器的抑制作用

7.2 结果与分析

7.2.1 优化Al掺杂纳米ZnO的制备工艺

7.2.2 Al掺杂纳米ZnO的表征

7.2.3 基于电流响应特性筛选不同吸附层数的（ALB/ZnO）酶膜

5的表征与GCE-（ALB/ZnO）₅的稳定性研究'>7.2.4 （ALB/ZnO）₅的表征与GCE-（ALB/ZnO）₅的稳定性研究

5的光电化学性能测定'>7.2.5 GCE-（ALB/ZnO）₅的光电化学性能测定

5的电化学行为研究'>7.2.6 GCE-（ALB/ZnO）₅的电化学行为研究

5对农药的响应'>7.2.7 GCE-（ALB/ZnO）₅对农药的响应

7.3 本章小结

8 酶纳米复合结构生物传感器的制备及其性能研究

8.1 材料和方法

8.1.1 主要药品试剂

8.1.2 仪器设备

8.1.3 不同类型的酶纳米复合结构生物传感器的制备与表征

8.1.4 不同类型的酶纳米复合结构生物传感器的比较研究

8.1.5 酶纳米复合结构生物传感器的工作条件筛选

8.1.6 酶纳米生物传感器的稳定性研究

8.1.7 酶纳米生物传感器的电化学行为

8.1.8 电化学检测农药对酶纳米生物传感器的抑制作用

8.2 结果与分析

8.2.1 酶纳米复合结构传感器的筛选

8.2.2 工作条件的选择

8.2.3 酶纳米复合结构生物传感器的稳定性研究

8.2.4 酶纳米复合结构生物传感器的电化学行为研究

8.2.5 酶纳米复合结构生物传感器对敌敌畏的响应

8.3 本章小结

9 酶纳米复合结构生物传感器的抗干扰和可再生性研究

9.1 材料和方法

9.1.1 主要药品试剂

9.1.2 仪器设备

9.1.3 酶纳米复合结构生物传感器的制备

9.1.4 三类物质对酶纳米复合结构生物传感器的干扰研究

9.1.5 酶纳米复合结构生物传感器的可再生研究

9.2 结果与分析

9.2.1 酶纳米复合结构生物传感器的抗干扰性研究

9.2.2 酶纳米复合结构生物传感器的活化物筛选

9.3 本章小结

10 酶纳米复合结构生物传感器检测农药的残留

10.1 材料和方法

10.1.1 主要药品试剂

10.1.2 仪器设备

10.1.3 酶纳米生物传感器的制备

10.1.4 酶生物传感器对农药的电化学响应

10.1.5 酶纳米生物传感器检测果蔬中农药残留

10.2 结果与分析

10.2.1 酶生物传感器对不同种类有机磷农药的测定

10.2.2 酶纳米生物传感器对氨基甲酸酯农药的检测

10.2.3 酶纳米生物传感器检测果蔬中残留的甲胺磷

10.2.4 酶纳米生物传感器检测果蔬中残留的西维因

10.3 本章小结

全文总结

参考文献

发表的学术论文

致谢

个人简历

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