论文题目: 产低温蛋白酶菌株的分离鉴定及其酶的提纯与特性研究
论文类型: 硕士论文
论文专业: 微生物学
作者: 刘静
导师: 闵航
关键词: 低温蛋白酶,金黄杆菌,分离鉴定,紫外诱变,粗酶提纯,纯酶性质
文献来源: 浙江大学
发表年度: 2005
论文摘要: 本论文从土壤中分离筛选出一株产低温蛋白酶的菌株HL221,并进行了菌株鉴定、诱变提高酶活、发酵条件优化、粗酶的提纯和酶学特质的研究。结果如下:1.菌株的分离筛选及鉴定 经过富集培养和分离纯化,获得了产低温蛋白酶的菌株HL221。经形态学观察、生理生化特征研究及16S rDNA序列比对结果表明该菌属于金黄杆菌属（Chryseobacterium sp.）菌株。2.紫外线诱变提高酶活 通过不同时间紫外照射进行菌种诱变,结果表明30s照射时间下,菌株产酶效果最佳,酶活由原出发菌株的110U/mL提高到230U/mL。3.发酵条件优化 通过单因子试验和正交试验,在摇瓶条件下对菌株的碳源、氮源、金属离子、培养温度、pH、接种量等产酶条件进行了优化。得到了菌株的最适产酶条件（g.L-1）为:葡萄糖30,蛋白胨15,Mn2+0.4,Tween80 0.1,K2HPO47,KH2PO43,培养温度25℃,培养基初始pH 7,接种量为2%-4%。在此优化条件下酶活可达到305.9U/mL。4.低温蛋白酶粗酶的提纯 粗酶液通过硫酸铵沉淀、G-75和DEAE Sepharose F.F.柱层析从发酵液分离纯化得到纯酶,经过纯化后的蛋白酶比活力达到6076.9U/mg,提纯倍数为27.2,得率为16.0%。5.低温蛋白酶纯酶特性 测得低温蛋白酶纯酶分子量为35 000Da,等电点为4.9。酶促反应最适温度25℃、最适pH为7。酶活在低于25℃、pH7～10范围内稳定,蛋白酶对酪蛋白的Km为3.1mg/mL。
论文目录:
摘要
ABSTRACT
文献综述
1 低温蛋白酶与低温微生物
2 低温微生物
2．1 低温微生物的分布及类群
2．2 低温微生物冷适应机制
2．2．1 调节膜脂组成
2．2．2 合成冷休克蛋白
2．2．3 独特的蛋白质结构
2．3 低温微生物的应用及前景
3 低温蛋白酶
3．1 低温蛋白酶的生理生化特征
3．2 低温酶冷适应机制
3．3 低温蛋白酶研究方法
3．4 低温蛋白酶的应用
4 本研究的目的及内容
第一章 产低温蛋白酶菌株的分离与鉴定
1 材料
1．1 样品及菌株分离
1．2 主要仪器
1．3 培养基
1．4 试剂
2． 方法
2．1 产蛋白酶菌株富集分离
2．2 复筛
2．3 蛋白酶粗酶活力测定
2．4 G+C mol%含量测定
2．5 16S rDNA的PCR扩增和测序
2．6 系统发育分析
2．7 常规分类鉴定
3． 结果与讨论
3．1 菌株筛选
3．1．1 初筛
3．1．2 菌种的复筛
3．2 分离菌株的鉴定
3．2．1 形态特征及培养特征
3．2．2 耐药性、耐盐度、温度、pH
3．2．3 其他生理生化特性
3．2．4 菌株对95种碳源利用测定
3．2．5 菌株的系统发育分析
第二章 紫外线诱变菌株提高酶量的研究
1 材料与方法
1．1 培养基
1．2 诱变处理
1．2．1 菌悬液的制备
1．2．2 紫外诱变处理
1．2．3 菌株筛选
1．3 蛋白酶的活性测定
2． 结果与讨论
2．1 菌株选育
2．2 诱变对菌种的影响
2．3 诱变菌株的产酶稳定性测定
第三章 菌株HL221产酶条件的优化
1 材料与方法
1．1 培养基
1．2 生长量的测定
2 结果与分析
2．1 培养条件对菌株生长和产酶的影响
2．1．1 产酶时间的优化
2．1．2 培养温度的优化
2．1．3 培养基pH的优化
2．1．4 接种量的优化
2．2 发酵培养基组成对菌株产酶的影响
2．2．1 碳源的优化
2．2．2 氮源的优化
2．2．3 金属离子对产酶的影响
2．3 条件优化的正交试验
2．4 粗酶特性
2．4．1 温度对粗酶酶活的影响
2．4．2 pH对粗酶酶活的影响
第四章 低温蛋白酶的纯化与特性研究
1 材料与方法
1．1 菌种
1．2 试剂和仪器
1．3 酶的分离纯化步骤
1．4 蛋白质含量的测定
1．5 电泳分析
1．6 凝胶电泳分析蛋白酶活性
2． 结果与分析
2．1 酶的提纯
2．1．1 粗酶液制备
2．1．2 (NH_4)_2SO_4分级沉淀
2．1．3 Sephadex G-75分子筛层析
2．1．4 DEAE Sepharose Fast Flow柱层析
2．1．5 提纯结果
2．2 酶学性质
2．2．1 蛋白酶的分子量和等电点的测定
2．2．2 最适温度和热稳定性
2．2．3 最适pH和对pH的稳定性
2．2．4 金属离子对酶活的影响
2．2．5 底物浓度对蛋白酶水解速度的影响——Km的测定
2．3 凝胶电泳分析蛋白酶活性
第五章 结论与展望
1 研究结论
2 展望
参考文献
发布时间: 2005-10-10
参考文献
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