Lb.paracasei HD1.7合成L-乳酸的发酵条件优化及代谢流分析

论文摘要

L-乳酸由于对人体无毒无害,具有杀菌作用,作为三大有机酸之一,用途广泛,其需求量在逐年增加。其聚合物聚乳酸由于机械性能和物理性能良好,并且具有生物可降解性,在国内外已经广泛应用于生物医学,医学,服装,包装等领域,具有广阔的市场前景,近来备受人们的关注。本实验室从酸菜汁中分离出一株能发酵产生具有高旋光纯度L-乳酸的菌株—Lb.paracasei HD1.7,经初步优化发现其L-乳酸的生产能力能得到大幅度提高,可知该菌株具有较高的开发和研究价值。本论文主要针对该菌株的培养基和培养条件进行了优化,通过对五种乳酸菌常用培养基的对比分析,得出MRS为该菌株产乳酸最适合培养基,并对培养基中的碳源、有机及无机氮源、磷源、金属离子进行了优化,优化后培养基中L-乳酸的产量为23.8g/L,比优化前的乳酸产量提高了2.4倍。然后,又针对种龄、接种量、发酵温度、pH等这些影响乳酸产量的发酵条件进行了深入细致的研究,得出了该菌株发酵产乳酸的最适合培养条件。在变温培养的条件下,将种龄为16h的种子培养基按5%的接种量,接种到发酵培养基中,用5M的氨水控制培养基的pH为5.86.0的条件下,该菌株发酵后,乳酸的产量达到90g/L,葡萄糖的转化率为90%。变温发酵是本研究中的一个创新点,研究结果表明, 42℃+37℃的变温培养模式与恒温37℃培养得到的乳酸产量相差无几,而在前者的发酵情况下,乳酸的发酵周期大约缩短10h,这对于后续的工业化生产具有非常现实的意义。此外,还研究了分批补加葡萄糖发酵对乳酸产量的影响,使乳酸最终产量提高到112g/L。最后,本研究将传统的发酵手段与新兴代谢手段相结合,根据已优化的培养基组成,利用新兴代谢工程的手段,构建该菌株产乳酸的代谢网络,利用化学计量学的方法,算出发酵过程中不同时间段内,各代谢中间产物的代谢通量分布,根据不同时间代谢流向分析得出,丙酮酸激酶,6-磷酸果糖激酶,L-乳酸脱氢酶为控制乳酸产量的关键节点,如果能从这三种酶着手,用基因工程手段进一步提高乳酸产量以及光学纯度,从根本上找出提高目标代谢产物——L-乳酸的产量的靶点,加以修饰限制,这样便可以克服传统发酵法筛选高产菌株的盲目性,从而做到有的放矢。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第1章 前言
• 1.1 乳酸的性质
• 1.1.1 乳酸的分子结构
• 1.1.2 乳酸的理化性质
• 1.2 乳酸的应用
• 1.2.1 乳酸在食品领域的应用
• 1.2.2 乳酸在医药领域的应用
• 1.2.3 乳酸在工业领域的应用
• 1.2.4 乳酸在农业中的作用
• 1.3 国内外乳酸供需情况
• 1.3.1 国内生产和消费情况
• 1.3.2 国际乳酸生产现状及市场前景
• 1.4 乳酸的生产方法
• 1.4.1 化学合成法
• 1.4.2 微生物发酵法
• 1.4.3 酶法发酵
• 1.5 发酵法生产乳酸
• 1.5.1 米根霉发酵生产乳酸
• 1.5.2 细菌法发酵生产乳酸
• 1.5.3 发酵法生产乳酸的研究进展
• 1.6 代谢工程简介
• 1.6.1 代谢工程背景
• 1.6.2 代谢流分析方法
• 1.6.3 代谢通量分析方法基本原理
• 1.6.4 代谢通量分析的意义
• 1.6.5 代谢流分析在乳酸发酵中应用
• 1.7 本研究的主要内容及目的意义
• 1.7.1 论文研究的目的意义
• 1.7.2 论文研究的主要内容
• 第2章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 主要实验仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 发酵过程
• 2.2.2 分析方法
• 2.2.3 培养基组分的优化
• 2.2.4 发酵条件的优化
• 2.2.5 分批补料发酵对乳酸产量的影响
• 2.2.6 传代试验验证该菌株乳酸产量的稳定性
• 2.2.7 Lb.paracaseiHD1.7 的代谢流分析
• 第3章 结果与分析
• 3.1 发酵液中乳酸含量及旋光性的测定
• 3.1.1 优化前发酵液中乳酸含量的测定
• 3.1.2 优化前乳酸旋光性的测定
• 3.2 最佳培养基的选择
• 3.2.1 不同培养基中菌体生长曲线
• 3.2.2 不同培养基中pH 值变化情况
• 3.2.3 不同培养基中糖利用率
• 3.2.4 不同培养基中乳酸产量情况
• 3.3 培养基组分的优化
• 3.3.1 碳源的优化
• 3.3.2 氮源的优化
• 3.3.3 磷源的优化
• 3.3.4 金属离子的优化
• 3.3.5 正交分析
• 3.3.6 验证分析
• 3.4 最佳培养条件的优化
• 3.4.1 最佳接种量的选择
• 3.4.2 最佳种龄的选择
• 3.4.3 最适培养温度的选择
• 3.4.4 最适pH的选择
• 3.5 分批补料对发酵的影响
• 3.5.1 不同时间分批补加葡萄糖对发酵产量的影响
• 3.5.2 补加葡萄糖方式对乳酸产量的影响
• 3.6 传代试验证明乳酸产量的稳定性
• 3.7 菌体干重对OD60011m 的标准校正曲线
• 3.8 Lb.paracaceiHD1.7 的代谢网络构建及其代谢通量分析
• 3.8.1 Lb.paracacei HD1.7 的代谢网络图及其化学计量关系
• 3.8.2 代谢通量的计算
• 3.8.3 结果和分析
• 第4章 讨论
• 4.1 中和剂对乳酸产量的影响
• 4.2 分批补料发酵方法对乳酸产量的影响
• 4.3 代谢通量分析可能存在的误差讨论
• 第5章 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢