去糖基化对蚯蚓纤溶酶部分生物学性质的影响

论文摘要

以大豆胰蛋白酶抑制剂SBTI为配基,Sepharose-4B为载体的亲和层析从赤子爱胜蚓（Eisenia foetida）匀浆液中分离出了蚯蚓纤溶酶全组分,采用DEAE-Cellulose-52禺子交换柱层析和制备电泳分离纯化了蚯蚓纤溶酶单组分EfP-I-1和EfP-I-2。纤维蛋白平板法和BAEE测得组分EfP-I-1的比活力分别为0.30 IU/μg和3.79 U/μg,组分EfP-I-2的比活力分别为0.41 IU/μg和6.13 U/μg。Schiffs试剂染色证明蚯蚓纤溶酶为一组糖蛋白组分,全组分的含糖量为2.98%,单组分EfP-I-1和EfP-I-2含糖量分别为5.71%和1.93%。三种凝集素ConA,LCA,AAL点印迹结果表明,EIP-I-1和EfP-I-2都具有末端甘露糖残基和核心岩藻糖结构的糖形。分别以三氟甲基磺酸去糖基化前后的蚯蚓纤溶酶全组分EFEs为抗原免疫家兔,Western-blotting和ELISA结果表明,两种抗原的免疫原性和免疫反应性没有明显的差别。单组分EfP-I-1和EfP-I-2经三氟甲基磺酸去糖基化后失去了抵抗胰蛋白酶水解的能力,而蚯蚓纤溶酶全组分经去糖基化后完全丧失了纤溶活性。以糖苷酶A对固定在Sepharose-4B-SBTI上的蚯蚓纤溶酶进行去糖链处理,ConA-HRP亲和印迹和Schiff’s染色结果表明,蚯蚓纤溶酶的糖链被去除,纤维蛋白平板法检测去除糖链后纤溶酶活性降低大约30%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 前言
• 1.1 蚯蚓纤溶酶简介
• 1.1.1 蚯蚓简介
• 1.1.2 蚯蚓纤溶酶简介
• 1.1.3 蚯蚓纤溶酶研究历史与现状
• 1.2 糖蛋白简介
• 1.2.1 糖蛋白简介
• 1.2.2 糖链在糖蛋白中的重要作用
• 1.2.3 糖链的研究意义
• 1.2.4 糖蛋白研究方法
• 1.3 本实验室前期相关工作
• 1.4 本实验研究意义及主要内容
• 第2章 蚯蚓纤溶酶全组分分离及单组分纯化
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 仪器
• 2.1.4 方法
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 蚯蚓纤溶酶全组分的分离
• 2.2.2 蚯蚓纤溶酶单组分的纯化
• 2.2.3 蚯蚓纤溶酶组分的活性测定
• 2.3 小结
• 第3章 蚯蚓纤溶酶糖链性质的初步鉴定
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 试剂
• 3.1.3 仪器
• 3.1.4 方法
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 Schiff's染色鉴定蚯蚓纤溶酶的糖蛋白
• 3.2.2 硫酸苯酚法测蚯蚓纤溶酶的糖含量
• 3.2.3 凝集素法分析蚯蚓纤溶酶糖链糖形
• 3.3 小结
• 第4章 TFMS去糖基化对蚯蚓纤溶酶性质的影响
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 试剂
• 4.1.3 仪器
• 4.1.4 方法
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 TFMS去除糖链效果的检测
• 4.2.2 蚯蚓纤溶酶去糖基化前后的免疫原性
• 4.2.3 蚯蚓纤溶酶去糖基化前后的免疫反应性
• 4.2.4 去糖基化前后EfP-I-1,EfP-I-2对胰蛋白酶的抗性
• 4.2.5 TFMS去除糖链后蚯蚓纤溶酶活性变化
• 4.3 小结
• 第5章 糖苷酶去糖基化对蚯蚓纤溶酶活性的影响
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 试剂
• 5.1.3 仪器
• 5.1.4 方法
• 5.2 结果与讨论
• 5.2.1 糖苷酶A对固定EFEs的去糖基化
• 5.2.2 蚯蚓纤溶酶经糖苷酶A去糖链后的酶活变化
• 5.3 小结
• 第6章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 硕士期间发表论文情况