蛛网膜下腔移植APA-NIH3T3/rPENK对大鼠神经性疼痛的镇痛效应

论文摘要

背景和目的神经性疼痛是由神经系统损伤或功能障碍所导致的，它是一种痛苦的神经疾病，目前传统的镇痛药尚不能有效地治疗。脑啡肽作为一种内源性阿片肽，其主要作用是通过抑制疼痛信息的传递来发挥镇痛效应。利用逆转录病毒载体，经过包装细胞系的包装，可将脑啡肽基因整合到靶细胞基因组中长期稳定表达。因此，可将转脑啡肽基因细胞移植于病人脊髓蛛网膜下腔，用于治疗神经性疼痛。然而潜在的宿主影响和严重的排异反应是异种移植不可避免的问题，为了防止移植排异反应，本研究应用海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠（APA）的方法将转脑啡肽基因NIH3T3细胞（NIH3T3／rPENK）进行微囊化包埋以达到免疫隔离的效果，然后将APA-NIH3T3／rPENK移植入大鼠脊髓蛛网膜下腔，观察APA-NTH3T3／rPENK对大鼠神经性疼痛的镇痛效应，检测大鼠脑脊液中脑啡肽含量的变化以及脊髓背角NMDAR2B蛋白的表达强度，探讨移植镇痛机制，同时了解APA微囊的免疫隔离效果，为APA-NIH3T3／rPENK脊髓蛛网膜下腔移植镇痛技术的临床应用提供实验依据。方法1、囊化细胞培养观察及脑啡肽分泌检测利用高压静电微囊制作仪，将转鼠脑啡肽基因NIH3T3细胞进行APA微囊化操作，混悬于含10％胎牛血清的DMEM中，37℃，5％CO2的孵箱条件下培养，镜下观察囊内细胞生长状况，每隔1天检测分泌到囊外的目的基因产物脑啡肽的浓厦。2、观察神经性疼痛动物模型热痛阈变化规律20只成年雄性SD大鼠被随机均分成2组：CCI模型组、CCI模型假手术组。CCI模型组，结扎右侧坐骨神经；CCI模型假手术组，仪暴露出右侧坐骨神经，不做结扎。术后第5天开始测量左右爪热痛阈，隔天测量1次，测量6周。3、移植观察镇痛效应30只成年雄性SD大鼠被随机均分成3组：空囊组（APA组）、裸细胞组（NIH3T3／rPENK组）和微囊化细胞组（APA-NIH3T3／rPENK组）。CCI手术后第12天，APA组向大鼠蛛网膜下腔植入40μl空囊悬液，约含空囊300个；NIH3T3／rPENK组向大鼠蛛网膜下腔植入40μlNIH3T3／rPENK悬液，约含细胞2×106个；APA-NIH3T3／rPENK组向大鼠蛛网膜下腔植入40μlAPA-NIH3T3／rPENK悬液，约含细胞2×106个。热痛阈测定：移植后第2天开始测量术侧后爪热痛阈，开始每天测量一次，5天后隔天测量，测量截止到移植术后21天。拮抗剂实验：移植术后第11天，3组大鼠分别腹腔注射阿片受体拮抗剂---纳洛酮（0.08mg／kg）。观察对止痛效果的影响。人工脑脊液灌流：用恒流输液泵将人工脑脊液灌入大鼠蛛网膜下腔，冰浴下收集脑脊液灌流液约1ml，沸水灭活，离心取上清，保存于-20℃待测。放射免疫法检测脑啡肽含量。NMDAR2B蛋白表达：移植术后第21天，应用NMDAR2B抗体进行免疫组织化学染色来鉴定脊髓背角NMDAR2B蛋白的表达强度。结果1、囊化细胞培养观察：随着培养时间的增加，细胞开始向周围增殖分裂并逐渐聚集生长。到第12天时，可见形成克隆状细胞团；囊膜对目的基因产物脑啡肽的通透性检测：培养第3天，脑啡肽浓度为12.9±1.6pg／ml，到第11天，增加达到197.0±38.1pg／ml。随着细胞在囊内的逐渐扩增，分泌到囊外的脑啡肽呈现出明显增加趋势。2、神经性疼痛动物模型热痛阈变化规律：CCI术后5天，坐骨神经结扎侧热痛阈低于对照侧，但差异不明显（P＞0.05）；CCI术后7天坐骨神经结扎侧热痛阈和对照侧相比，差异具有显著的统计学意义（P＜0.05）：COI术后7～33天，结扎侧和对照侧热痛阈差异均具有显著的统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；CCI术5周以后，结扎侧热痛阈逐渐升高，和对照侧相比，差异均不明显（P＞0.05）。假手术组，各天左右爪热痛阈差异均不明显（P＞0.05）。3、移植术后热痛阈测定：APA组移植前后热痛阈未见明显变化；与APA组相比，接受NIH3T3／rPENK移植组在移植后3～21天，接受APA—NIH3T3／rPENK移植组在移植后5～21天，热痛阈都明显高于APA组（P＜0.01或P＜0.05）；与APA—NIH3T3／rPENK组相比，两周以后，接受NIH3T3／RPENK移植组热痛阈明显低于APA-NIH3T3／rPENK组（P＜0.05）。说明NIH3T3／rPENK植入大鼠的蛛网膜下腔对大鼠的神经性疼痛有镇痛作用，且这种作用随时间而减弱。APA微囊具有良好的免疫隔离作用，包裹以后能延长NIH3T3／rPENK细胞的镇痛时间，提高移植两周以后的镇痛效果。4、拮抗剂试验：移植术后第11天，3组大鼠分别腹腔注射阿片受体拮抗剂---纳络酮，APA组注射前后热痛阈比较差异不明显（P＞0.05）；NIH3T3／RPENK和APA-NIH3T3／rPENK组，与注射前比较，注射后热痛阈明显降低（P＜0.01），镇痛效应被纳洛酮翻转。5、脑脊液灌流液中脑啡肽的含量：移植21d后，APA组脑脊液灌流液中亮氨酸脑啡肽（leucine-enkephalin,L-EK）含量显著低于NIH3T3／rPENK组和APA-NIH3T3／rPENK组（P＜0.01）；NIH3T3／rPENK组脑脊液灌流液中L-EK含量显著低于APA-NIH3T3／rPENK组（P＜0.01）。说明大鼠蛛网膜下腔移植NIH3T3／rPENK可以提高脑脊液灌流液中脑啡肽的含量，APA微囊包裹可延长升高的时间。6、NMDAR2B蛋白表达：移植21天后，APA组大鼠结扎侧脊髓背角NMDAR2B阳性蛋白积分光密度明显高于NIH3T3／rPENK、APA—NIH3T3／rPENK和正常对照组（P＜0.01）；NIH3T3／rPENK组明显高于APA—NIH3T3／rPENK和正常对照组（P＜0.05）：而APA—NIH3T3／rPENK和正常对照组未见明显差异（P＞0.05）。说明移植3周后，NIH3T3／rPENK移植能抑制神经性疼痛大鼠脊髓背角NMDAR2B蛋白表达，且APA微囊包裹后效果更好。结论NIH3T3／RPENK或APA-NIH3T3／rPENK植入大鼠的蛛网膜下腔均可以明显减轻神经痛人鼠的热痛敏感行为，这与移植物持续不断释放脑啡肽并作用于阿片受体相关。NIH3T3／RPENK或APA-NIH3T3／rPENK植入大鼠的蛛网膜下腔均可以明显地抑制脊髓背角NR2B蛋白表达，提示移植物可能通过抑制NR2B蛋白表达而发挥镇痛作用。与NIH3T3／RPENK移植相比，APA-NIH3T3／rPENK可以明显提高镇痛效果，提示APA微囊具有良好的免疫隔离作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 论文 蛛网膜下腔移植APA-NIH3T3/rPENK对大鼠神经性疼痛的镇痛效应
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 神经性疼痛研究现状
• 参考文献
• 缩略词表
• 致谢