转基因白桦中外源基因表达及其主要影响因素研究

论文摘要

本文以自然环境条件下生长的4-5年生转基因白桦（Betula platyphylla）为研究材料,通过Northern杂交与半定量RT-PCR方法对外源基因的转录表达进行检测,并结合外源基因的整合特性以及外源基因启动子和编码区DNA甲基化情况等主要影响表达的因素进行分析,所得结果如下:1.在检测的23株转基因白桦（bt和蜘蛛杀虫肽嵌合基因（本文中简称bt）,nptⅡ和gus）中,nptⅡ基因全部稳定表达,占总数的100%;18株gus基因稳定表达,占总数的78.3%;18株bt基因稳定表达,占总数的78.3%。这些植株在三年间表达稳定,从5月份到9月份（包括5月和9月）的检测结果显示,随着时间的推移,外源基因的表达量呈下降趋势。另外,同一植株的不同组织器官中外源基因的转录表达存在差异,叶＞雄花和雌花＞枝皮和木质部＞根。2.gus基因的检测结果表明,植株TP96、TP74、TP73、TP30、TP28发生转录水平沉默;TP67和TP46发生转录后水平沉默。3.在供试的22株转基因白桦中,bt基因单拷贝的4株、2个拷贝2株、3个拷贝12株、4个拷贝2株。其中54.5%的植株为3个拷贝,68%的植株bt基因与gus基因的拷贝数不一致,且外源基因的沉默与T-DNA拷贝数联系不紧密。另外,在检测的28株转基因白桦中大部分都含有载体序列（某段或全部）,不含载体序列的3株仅占总数的10.7%。4.甲基化敏感酶的限制性内切酶结合Southern杂交分析法和亚硫酸盐测序法得出的数据显示,DNA甲基化对转基因白桦的表达有影响,但却不是影响表达的唯一因素,此外对于不同的植株作用的程度也存在差异。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 白桦简述
• 1.1.1 白桦的分类地位及经济价值
• 1.1.2 转基因白桦研究的进展
• 1.2 影响外源基因表达的因素
• 1.2.1 外源基因的整合特性对外源基因表达的影响
• 1.2.2 DNA甲基化对外源基因表达的影响
• 1.2.3 外界环境条件及生长发育对外源基因表达的影响
• 1.3 林木中外源基因表达及稳定性研究进展
• 1.4 植物 DNA甲基化
• 1.4.1 植物 DNA甲基化的相关机制
• 1.4.2 植物 DNA甲基化的功能
• 1.5 植物 DNA甲基化研究策略
• 1.5.1 高效液相色谱法
• 1.5.2 亚硫酸盐测序法
• 1.5.3 甲基化敏感的限制性内切酶结合 Southern杂交分析法
• 1.5.4 MSAP法
• 1.6 本研究的目的和意义
• 2 外源基因在转基因白桦中的表达特性及稳定性
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 主要试剂及仪器
• 2.1.3 方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 无性系间转录表达差异
• 2.2.2 转录表达检测
• 2.2.3 gus基因组织化学法检测
• 2.3 讨论
• 2.3.1 外源基因在转基因白桦中的表达分析
• 2.3.2 白桦成熟叶片总 RNA的提取
• 2.4 本章小结
• 3 外源基因在转基因白桦中的整合特性
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 主要试剂和仪器
• 3.1.3 方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 多重 PCR检测外源基因整合稳定性
• 3.2.2 利用 PstI单酶切基因组 DNA检测外源基因整合的拷贝数
• 3.2.3 DraI和 PstI酶切基因组 DNA检测bt基因的整合完整性
• 3.2.4 PCR检测载体污染
• 3.3 讨论
• 3.4 本章小结
• 4 外源基因启动子区及编码区DNA甲基化分析
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 同裂酶结合 Southern杂交分析法检测外源基因编码区的甲基化
• 4.2.2 亚硫酸盐测序法检测 DNA甲基化
• 4.3 讨论
• 4.4 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢