论文摘要
牛乳过敏是一种常见的食物过敏反应,约1%～2%的成人和高达8%的三岁以下儿童会对牛乳产生食物过敏反应。β-乳球蛋白是公认的主要乳过敏原之一,大约82%的牛乳过敏患者对β-乳球蛋白过敏。由于牛乳β-乳球蛋白与水牛乳β-乳球蛋白的同源性很高,存在免疫交叉反应。因此,探索水牛乳β-乳球蛋白的过敏问题具有重要的价值。本论文开展的研究工作包括水牛乳β-乳球蛋白的分离纯化、兔抗水牛乳β-乳球蛋白的抗原性评估、水牛乳β-乳球蛋白线性表位和构象型表位的定位,研究的主要方法、结果及结论如下:1.水牛乳乳清经过柱层析的分离后,采用SDS-PAGE、IEF-PAGE和ESI-Q-TOF-MS等方法对对分离组分进行鉴定。结果表明,本研究建立的DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换结合Sephadex G-75凝胶层析方法可以分离纯化水牛乳β-乳球蛋白,该方法分离得到的水牛乳β-乳球蛋白的抗原性完整,纯度高达90%以上,并且适用于实验室小量和中量制备。2.以纯化的水牛乳β-乳球蛋白为抗原,按常规的免疫程序对日本大白耳兔进行免疫,间接非竞争ELISA检测结果表明,日本大白耳兔对纯化的水牛乳β-乳球蛋白具有很好的免疫应答。通过间接ELISA、竞争抑制ELISA以及免疫印迹实验,结果表明本研究分离纯化的水牛乳β-乳球蛋白的抗原性完好,并证明了水牛乳β-乳球蛋白与牛乳β-乳球蛋白存在较强的免疫交叉反应,交叉率达到69.27%。3.根据亲和层析原理,将纯化的水牛乳β-乳球蛋白耦联到溴化氰活化的Sepharose4B的免疫亲合柱上,用3mol/L MgCl2将特异性兔血清IgG抗体洗脱,得到了SDS-PAGE纯的IgG,其蛋白含量可达5.8mg/mL,经ELISA检测抗体效价滴度为1:109。因此,本研究建立的方法可用于纯化兔血清中特异性的IgG抗体。4.通过生物信息学分析,借助LaserGene软件和网络服务器,分别按Kyte-Doolittle方案预测水牛乳β-乳球蛋白的亲水性区、Jameson-Wolf方案评估蛋白质的抗原性指数的高低、Emini方案寻找其表面可及性的位点,同时分别对其二级结构的柔韧性区域、转角和无规则卷曲的易形成区进行预测,最后对以上多参数综合分析,预测出了5个可能含有多个线性表位的区域:AA30-45,AA67-78,AA97-115,AA124-141,AA150-156。5.通过采用特异性兔血清对噬菌体随机七肽库进行亲和淘选,在随机挑选的300个克隆子中,筛选到了99个阳性克隆子,借助网络工具MIMOX分析,定位出了水牛乳β-乳球蛋白的6个模拟表位区:AA14-20,AA26-32,AA36-42,AA70-80,AA82-86以及AA149-156,其中AA70-80和AA149-156为主要表位区。6.在表位预测和噬菌体肽库筛选的基础上,采用肽扫描定位的方法,寻找到了水牛乳β-乳球蛋白的兔血清IgG结合的7个线性表位,它们分别是AA21-30（SLAMAASDIS）AA25-34（AASDISLLDA）、AA29-38（ISLLDAQSAP）、AA77-86（KIPAVFKIDA）、AA87-96（LNENKVLVLD）、AA134-143（EKFDKALKAL）和AA150-159（AFNPTQLEGQ）。7.表位预测与表位筛选结果表明,30%的预测表位区出现在肽库筛选的模拟表位中,而40%筛选的表位区未能通过生物信息学的方法预测到。与已报道的牛乳β-乳球蛋白的IgG结合表位相比,本研究发现了两个兔血清IgG结合的新表位,它们分别是AA134-143（EKFDKALKAL）和AA150-159（AFNPTQLEGQ）。8.通过对噬菌体环七肽库的淘选,筛选到了水牛乳β-乳球蛋白的兔血清IgG结合的构象型模拟肽,以此为基础,借助生物信息学的分析,定位出了水牛乳β-乳球蛋白的兔血清IgG结合的2个构象型表位:Ser-Pro-Leu-Thr-Glu-Asn-Lys和Pro-Leu-Asn-Glu-Asn-Lys-Asn。9.建立了噬菌体环七肽库筛选组合网络工具MIMOX定位构象型表位的方法,该方法可以应用于食物过敏原的构象型表位定位。