甲基对硫磷降解菌的分离鉴定及水解酶基因克隆表达

论文摘要

甲基对硫磷（methyl parathion,简称MP）是一种高效高毒的有机磷农药,其主要的中间代谢产物为对硝基苯酚（p-nitrophenol,简称PNP）,易溶于水,中等毒性。由于二者含有苯环结构,残留期长,给人类健康带来潜在威胁。利用微生物对有机磷农药的降解性能消除其在环境中的残留,具有高效率、低成本、无二次污染、降解彻底等优点,是修复有机磷农药污染土壤的有效途径之一。本文从湖北沙隆达农药厂污水处理池的污泥中分离筛选到多株能降解甲基对硫磷的菌株,其中菌株HS-D36具有较好的降解性能。结合生理生化及16S rDNA对其进行了鉴定,并采用高效液相色谱法和分光光度法对其降解特性进行了研究。结果表明,HS-D36能以甲基对硫磷为唯一碳源和氮源生长;该菌在3h内能降解50mg/L MP 90%,在12h内将50mg/L PNP完全降解;在以MP为唯一碳源的无机盐培养基上可以耐受800mg/L的MP,在LB培养基上可耐受2,000mg/L MP。利用HS-D36基因组DNA,PCR扩增出16S rDNA片断,测序并进行BLAST检索比对,表明HS-D36与施氏假单胞菌属（Pseudomonas stutzeri）的同源性为100%。结合生理生化特性,确定HS-D36为施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）,命名为Pseudomonas stutzeri HS-D36。以HS-D36基因组DNA为模板,用PCR法克隆其水解酶基因mpd。将克隆到的mpd基因进行测序,其结构基因全长为996bp,在GenBank中注册,序列号为EF515812。测序结果在Genebank nucleic-nucleic Blast进行比对,发现与其它甲基对硫磷降解菌的mpd基因同源性高达99%,说明该菌的mpd基因可能是甲基对硫磷水解酶基因的同源基因。将HS-D36的mpd基因首先克隆至载体pMD-18,得到重组克隆载体pMD-mpd;然后亚克隆到高效表达载体pET-28,得到重组表达载体pET-mpd。将重组表达载体pET-mpd转化大肠杆菌BL21菌株,使mpd基因得到高效表达。SDS-PAGE蛋白电泳得到在35kD处的强特异性条带。从重组工程菌中提取甲基对硫磷水解酶粗酶液,初步研究了其酶学特性,发现其最适温度为30℃、最适pH值为10.0,金属离子Fe3+、Cr2+、Co2+对其活力有不同程度的激活效应,Na+、Ni2+、Cu2+、K+、Mg2+、Zn2+则对其活力有抑制作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1. 引言
• 1.1 农药与环境污染
• 1.2 有机磷农药的使用现状及中毒机理
• 1.3 微生物降解有机磷农药的研究进展
• 1.3.1 降解有机磷农药的微生物种类及筛选
• 1.3.2 微生物降解有机磷农药的降解机理与代谢途径
• 1.3.3 影响农药降解的因素
• 1.3.4 有机磷农药降解酶基因的克隆
• 1.3.5 降解酶的特性研究及工程菌的构建
• 1.4 本文研究的目的和意义
• 2. 实验材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 药品和试剂
• 2.1.3 主要仪器和设备
• 2.1.4 培养基与试剂配制
• 2.1.5 常用缓冲液
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 菌株的富集培养及分离纯化
• 2.2.2 形态观察和生理生化鉴定
• 2.2.3 基因组DNA的提取
• 2.2.4 细菌16S rDNA的PCR扩增
• 2.2.5 菌株HS-D36对甲基对硫磷的降解特性研究
• 2.2.6 菌株HS-D36反硝化能力的测定
• 2.2.7 DNA片段的连接转化
• 2.2.8 细菌质粒的提取
• 2.2.9 DNA限制性内切酶消化
• 2.2.10 DNA片段的回收
• 2.2.11 甲基对硫磷水解酶基因（mpd）的克隆
• 2.2.12 原核细胞中重组质粒的筛选
• 2.2.13 MPD蛋白的原核表达及表达产物的SDS-PAGE分析
• 2.2.14 重组甲基对硫磷水解酶MPD的初步研究
• 3. 实验结果
• 3.1 甲基对硫磷菌株的分离和鉴定
• 3.2 形态观察及生理生化鉴定
• 3.2.1 降解菌形态观察
• 3.2.2 降解菌的生理生化鉴定
• 3.2.3 菌株的生长曲线的测定
• 3.3 降解菌16S rDNA的鉴定
• 3.3.1 降解菌基因组DNA的提取
• 3.3.2 降解菌的16S rDNA的测序
• 3.3.3 降解菌的系统进化分析
• 3.4 菌株降解性能分析
• 3.4.1 菌株HS-D36降解性能分析
• 3.4.2 菌株HS-D36反硝化能力的研究
• 3.5 甲基对硫磷水解酶基因mpd克隆表达
• 3.5.1 PCR扩增甲基对硫磷水解酶基因mpd
• 3.5.2 重组质粒pMD-mpd的构建及鉴定
• 3.5.3 重组表达质粒pET-mpd的构建及鉴定
• 3.5.4 mpd基因在大肠杆菌BL21中的表达与鉴定
• 3.6 粗酶液活性的初步分析
• 3.6.1 对硝基苯酚标准曲线和蛋白质标准曲线的制作
• 3.6.2 酶反应的最适温度、pH
• 3.6.3 金属离子对重组酶粗酶液的影响
• 4 讨论
• 4.1 野生型菌株与重组工程菌
• 4.2 降解途径的分析
• 4.3 降解基因的克隆表达
• 4.4 后续工作设想
• 5 结论
• 附录
• 参考文献
• 硕士期间发表的论文
• 致谢