梨抗黑星病突变体离体筛选

论文摘要

以砀山酥梨材料,以叶片为外植体,建立了砀山酥梨叶片高效再生体系。通过梨黑星病病原菌培养和粗毒素提取,研究了梨黑星病病原菌粗毒素的产生条件和毒素生物活性。同时,研究了梨黑星菌粗毒素对不同抗性梨品种离体叶片生理特性的影响。最后,以砀山酥梨叶片为外植体,以梨黑星病病原菌培养滤液即粗毒素作为筛选剂,采用一步筛选法和多步筛选法,在不同浓度毒素的培养基上筛选抗性愈伤组织,建立了抗梨黑星病的筛选体系,获得了抗病突变体植株。主要研究结果如下:1.以砀山酥梨叶片为外植体,首次系统地研究了基本培养基、植物生长调节剂、碳源、暗培养时间和琼脂用量等对其再生不定芽的影响。结果表明,砀山酥梨叶片再生不定芽的适宜组合为NN69+6-BA 2.5mg·L-1+IBA 0.3mg·L-1+山梨醇20g·L-1+琼脂8.0 g·L-1,暗培养20d。叶片再生频率最高为83%,平均再生芽数2.17。叶片再生苗在生根培养基1/4 MS+IBA 0.5mg·L-1+ NAA 0.3mg·L-1+蔗糖20g·L-1+琼脂6.0g·L-1上已经生根。2.研究了梨黑星病病原菌株在不同培养基、光照、温度、pH值、培养时间和震荡培养方式等条件下产生毒素的情况,并用砀山酥梨种子发芽法,叶片测定法,试管苗根、茎生长测定法检测了毒素的毒性。结果表明,适宜梨黑星病菌粗毒素培养的培养基为PDA液体培养基,培养基pH值为6.0,培养温度22℃,在黑暗下110 r·min-1连续震荡培养22d时产生的毒素毒性最强。采用四种方法都可检测到毒素的活性。3.以不同抗病性梨品种为材料,研究了梨黑星菌粗毒素对梨离体叶片的过氧化物酶（POD）活性、苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性、丙二醛（MDA）含量、细胞膜相对透性以及叶绿素含量变化的影响。结果表明,毒素接种后抗病和感病品种叶片的POD和PAL活性、MDA含量和相对电导率均呈上升趋势,其间会有一个或两个峰值出现,且抗病品种叶片的POD和PAL活性高于感病品种,而细胞内MDA含量和相对电导率增加比率低于感病品种;同时,毒素使梨离体叶片的叶绿素、类胡萝卜素含量下降,且感病品种的下降幅度大于抗病品种。总体来说,梨离体叶片POD和PAL的活性变化与梨品种抗病性呈正相关,叶片MDA含量和相对电导率变化与梨品种抗病性呈负相关,抗病品种对毒素的毒害有更好的抵抗力。4.用砀山酥梨的叶片及其产生的愈伤组织作为筛选材料,以梨黑星病病原菌粗毒素为筛选压力,采用一步筛选法和多步筛选法,筛选梨抗黑星病突变体。结果表明:砀山酥梨叶片及其产生的愈伤组织忍耐的最大粗毒素浓度为50%,且粗毒素对叶片愈伤组织的诱导及分化有显著的抑致作用,随着粗毒素浓度的上升,抑致作用增强。通过接种病原菌试验和叶片伤害试验鉴定,发现筛选株系耐病性明显高于对照,说明筛选株系有抗病性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 梨黑星病研究进展
• 1.1.1 症状
• 1.1.2 病原菌
• 1.1.3 病原菌生理分化
• 1.1.4 发病规律
• 1.1.4.1 病原菌越冬及初侵染源
• 1.1.4.2 梨黑星病菌的侵染
• 1.1.4.3 病原菌的传播及病害流行规律
• 1.1.5 抗行遗传和抗病机制
• 1.1.5.1 抗性遗传
• 1.1.5.2 抗病机制
• 1.1.6 防治方法
• 1.1.6.1 抗性育种
• 1.1.6.2 农业防治
• 1.1.6.3 果实套袋
• 1.1.6.4 化学防治
• 1.2 植物病原真菌毒素
• 1.2.1 植物病原真菌毒素的寄主选择活性
• 1.2.2 植物病原真菌毒素生物活性测定方法
• 1.2.2.1 生物测定
• 1.2.2.2 物理及化学方法检测
• 1.2.2.3 生理生化方法检测
• 1.2.3 植物抗病生理的研究
• 1.2.4 真菌毒素的致病机理
• 1.2.4.1 毒素对细胞质膜的影响
• 1.2.4.2 毒素对线粒体和叶绿体的影响
• 1.2.4.3 对寄主生理代谢的影响
• 1.2.5 植物病原菌毒素的应用
• 1.2.5.1 在植物病害化学防治上的应用
• 1.2.5.2 在真菌分类上的应用
• 1.2.5.3 在抗病育种上的应用
• 1.2.5.4 在品种抗性鉴定中的应用
• 1.2.5.5 毒素物质的利用及开发
• 1.3 植物体细胞无性系变异
• 1.3.1 体细胞无性系变异的类型
• 1.3.2 体细胞无性系变异的来源和产生机理
• 1.3.2.1 植物体细胞无性系分子水平上的变异
• 1.3.2.2 植物体细胞无性系细胞水平上的变异
• 1.3.3 组织培养诱导产生的变异
• 1.3.3.1 培养类型和生长调节物质
• 1.3.3.2 植株的基因型
• 1.3.3.3 离体培养时间
• 1.3.3.4 选择压
• 1.3.4 检测
• 1.3.4.1 形态检测
• 1.3.4.2 细胞遗传检测
• 1.3.4.3 次生代谢物含量和种类检测
• 1.3.4.4 分子检测
• 1.4 体细胞突变体筛选
• 1.4.1 抗病突变体的选择方法和步骤
• 1.4.2 毒素作为筛选因子的条件
• 1.4.3 毒素处理
• 1.4.3.1 选择剂
• 1.4.3.2 筛选材料的选择
• 1.4.3.3 筛选浓度
• 1.4.4 抗性鉴定
• 1.4.5 利用致病毒素筛选抗病突变体的成功实例
• 1.4.6 体细胞无性系突变体筛选的优点及不足
• 1.5 选题目的和意义
• 第二章 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料及菌株
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 仪器及设备
• 2.1.4 培养基及其制备
• 2.2 方法
• 2.2.1 砀山酥梨叶片高效再生体系的建立
• 2.2.1.1 砀山酥梨无菌苗的培养
• 2.2.1.2 叶片再生操作
• 2.2.1.3 培养基对叶片再生的影响
• 2.2.1.4 IBA 对叶片再生的影响
• 2.2.1.5 细胞分裂素对叶片再生的影响
• 2.2.1.6 碳源对叶片再生影响
• 2.2.1.7 琼脂用量对叶片再生的影响
• 2.2.1.8 暗培养时间对叶片再生的影响
• 2.2.2 梨黑星病菌产毒条件及毒素毒性检测
• 2.2.2.1 粗毒素提取
• 2.2.2.2 毒素毒性生物检测
• 2.2.2.3 不同培养基对病原菌产毒的影响
• 2.2.2.4 不同温度对病原菌产毒的影响
• 2.2.2.5 不同光照对病原菌产毒的影响
• 2.2.2.6 不同震荡培养方式对病原菌产毒的影响
• 2.2.2.7 不同pH 值对病原菌产毒的影响
• 2.2.3 梨黑星菌粗毒素对不同抗性梨品种的生理效应研究
• 2.2.3.1 梨黑星菌粗毒素的提取
• 2.2.3.2 过氧化物酶（POD）活性的测定
• 2.2.3.3 苯丙氨酸氨解酶（PAL）活性的测定
• 2.2.3.4 丙二醛（MDA）含量的测定
• 2.2.3.5 细胞膜相对透性的测定
• 2.2.3.6 叶绿素、类胡萝卜素含量的测定
• 2.2.4 砀山酥梨抗病突变体的筛选与初步鉴定
• 2.2.4.1 梨黑星菌粗毒素对砀山酥梨叶片愈伤组织诱导分化的影响
• 2.2.4.2 抗性细胞系的筛选
• 2.2.4.3 存活细胞系的植株再生
• 2.2.4.4 抗性细胞系再生植株初步鉴定
• 第三章 结果与分析
• 3.1 砀山酥梨叶片高效再生体系的建立
• 3.1.1 叶片不定芽再生
• 3.1.2 细胞分裂素对叶片再生的影响
• 3.1.3 IBA 对叶片再生的影响
• 3.1.4 基本培养基对叶片再生的影响
• 3.1.5 碳源对叶片再生的影响
• 3.1.6 琼脂对叶片再生的影响
• 3.1.7 暗培养对叶片再生的影响
• 3.1.8 不定芽的生长和生根
• 3.2 梨黑星病菌产毒条件及毒素毒性检测
• 3.2.1 不同培养基对菌株产生毒素毒性的影响
• 3.2.2 不同温度对菌株产生毒素毒性的影响
• 3.2.3 不同光照对菌株产生毒素毒性的影响
• 3.2.4 不同震荡培养方式对菌株产生毒素毒性的影响
• 3.2.5 不同pH 值对菌株产生毒素毒性的影响
• 3.3 梨黑星菌粗毒素对不同抗性梨品种的生理效应研究
• 3.3.1 毒素接种对梨叶片中 POD 的活性影响
• 3.3.2 毒素接种对梨叶片中 PAL 的活性影响
• 3.3.3 毒素接种对梨叶片中MDA含量的影响
• 3.3.4 毒素接种对梨叶片细胞膜相对透性的影响
• 3.3.5 毒素接种对梨叶片叶绿素、类胡萝卜素含量的影响
• 3.4 砀山酥梨抗病突变体的筛选与初步鉴定
• 3.4.1 梨黑星菌粗毒素对砀山酥梨叶片愈伤组织诱导分化的影响
• 3.4.2 抗性细胞系的筛选
• 3.4.3 抗性细胞系再生植株初步鉴定
• 第四章 讨论
• 4.1 砀山酥梨叶片高效再生体系的建立
• 4.2 梨黑星病菌产毒条件及毒素毒性检测
• 4.3 梨黑星菌粗毒素对不同抗性梨品种的生理效应研究
• 4.4 砀山酥梨抗病突变体的筛选与初步鉴定
• 第五章 结论
• 参考文献
• 附录
• 英文缩写词
• 致谢
• 作者简介