论文摘要
目的:非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis,NASH）是一种遗传-环境-代谢相关性疾病,是以肝细胞弥漫性脂肪变性和炎症为特征的临床病理综合征。近年来,随着人们生活水平的提高,NASH的发病率逐年上升,且发病年龄趋于年轻化。目前,NASH不再被认为是一种良性病变,而被认为是严重肝病的前兆,是引起脂肪性肝硬化的重要原因之一。对于NASH的发病机制尚未完全明了,而在治疗上也无有效的方法。环氧合酶（cyclooxygenase,COX）是体内催化花生四烯酸分解为前列腺素（prostaglandins,PGs）的关键酶。在人体内,COX主要有二种类型:既结构型COX-1和诱导型COX-2。COX-2是迅速短暂的早期即刻基因,呈诱导型表达,即正常生理状态下在多数组织中不表达,而当受到包括有丝分裂原、细胞因子、炎症介质、细菌内毒素等刺激因素作用时,其表达迅速上调。COX-2及其代谢产物PGs参与炎症反应、细胞增殖、肿瘤血管生成等多种病理生理过程。但COX-2在NASH中的表达及作用机制目前研究甚少。本研究的目的旨在应用高脂饮食制备NASH大鼠模型,以逆转录-聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction , RT-PCR ）及免疫组织化学染色（immunohistachemistry staining）的方法观察COX-2 mRNA及COX-2蛋白在NASH模型大鼠肝组织中的表达情况,以探讨COX-2在NASH发病机制中的表达及意义,为有效防治NASH提供一条新思路。方法:选用健康雄性Wistar大鼠16只,体重140±10g,随机分为两组:正常对照组8只:以标准饲料喂养;模型组8只:以高脂饲料（2%胆固醇+10%猪油+5%玉米油）喂养,于16周末处死全部大鼠。留取标本用于以下项目检测:日本Olympus AU 2700全自动生化分析仪测定血清胆固醇（cholesterol,TC）、甘油三酯（triglyceride,TG）、丙氨酸氨基转移酶（alanine transaminase,ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（ aspartate transaminase , AST ）。酶联免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）法检测血清中肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）的水平。苏木精-伊红（hematoxylin-eosin,HE）染色观察肝组织普通病理改变,SudanⅣ染色观察肝细胞脂肪变性程度。免疫组织化学SP法及RT-PCR分别检测COX-2蛋白和COX-2mRNA在大鼠肝脏中的表达情况。凝胶电泳迁移率改变分析（electrophoretic mobility shift assay,EMSA）检测肝组织核转录因子κB（nuclear factor-κB,NF-κB）的活性变化。结果:1.血清生化指标变化:模型组大鼠血清TC、TG、ALT、AST、TNF-α水平分别为（2.95±0.32,0.88±0.17,96.63±14.16,156.13±14.74,48.23±3.38）明显高于正常组（1.80±0.22,0.51±0.16,39.50±12.19,71.25±14.40,1.74±1.30）（p<0.01）。2.肝脏的病理学变化:肉眼下观察,正常大鼠肝脏呈红褐色,明亮有光泽。模型组大鼠肝脏肿大,边缘钝,呈浅黄色或土黄色,切面油腻,可见局灶性黄白相间灶。16周末,光镜下可见,正常组大鼠肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列;模型组大鼠肝细胞中均出现中、重度的脂肪变性,伴有小叶内炎症,及点状或灶性坏死。大部分出现汇管区扩张,炎症细胞浸润。3.免疫组化法检测大鼠肝组织COX-2蛋白的表达:光镜下,正常组大鼠肝脏内无COX-2蛋白的表达。模型组大鼠肝细胞及肥大的枯否细胞胞浆内有棕黄色的颗粒。每张切片均取四周及中央五个四野,采用病理图像分析仪分析COX-2在肝脏中的表达量。结果:模型组大鼠肝组织COX-2的表达量（0.846±0.051）明显高于正常组（p<0.01）。4. RT-PCR法检测COX-2 mRNA的表达量:正常组大鼠肝组织中COX-2 mRNA无表达,模型组COX-2 mRNA表达增高（0.854±0.025）,二者比较有显著性差异（p<0.01）。5. EMSA检测大鼠肝组织NF-κB活性:高脂组NF-κB活性（10.12±1.34）高于正常对照组（1.58±1.23）（p<0.05）。结论:1应用高脂饮食可以成功复制NASH大鼠模型,NASH大鼠血清TNF-α水平明显升高,TNF-α可诱导NF-κB的活化,进而导致COX-2表达升高,同时,COX-2的表达又可诱导以TNF-α为代表的细胞因子释放增加,这些因素共同参与NASH的发生发展。2 COX-2在NASH大鼠肝组织表达明显增高,高表达的COX-2不仅可导致脂质代谢紊乱,而且可诱导炎症因子释放。总之,COX-2在NASH大鼠肝组织脂质沉积-炎症反应介质释放-肝脏受损这一级联反应中起着重要作用,抑制其表达可能是NASH大鼠肝组织病变减轻的一个重要因素,这为进一步研制有效的NASH防治药物提供新的理论依据。
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