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玫瑰红景天有效成分分离纯化及结构鉴定

2020-12-07阅读(747)

玫瑰红景天有效成分分离纯化及结构鉴定

论文摘要

玫瑰红景天在中国和东欧国家是一种有名的传统药用植物,具有去疲劳、增强学习和记忆、兴奋中枢神经系统、提高工作效率、耐缺氧、改善睡眠、预防高原病、抗癌等多种生理功能,目前是一种很受欢迎的药食两用“适应原”植物。本文对该种植物中两种主要的活性成分的提取分离纯化工艺进行了系统的研究,同时对其中的一些植物化学成分进行了分离分析和结构鉴定,建立了不同红景天品种的指纹图谱,为玫瑰红景天资源的深度开发和在医药工业中的应用提供依据。1.在单因素实验的基础上,利用正交组合实验方法研究了三个主要提取因素对两种主要成分（salidroside和rosavin）提取率的影响,得到因素与得率的回归模型及三因素之间相互作用的响应面图。确定两成分提取的最佳工艺条件为:乙醇浓度为70% （v/v）,料液比为1:10 （w/v）,温度为75℃,提取二次,每次提取时间1h。在最优条件下,两成分的提取率分别为0.80%和0.37%。同时研究了提取过程的动力学和热力学,利用范德霍夫方程计算热力学参数（ΔH0,ΔS0和ΔG0）。研究结果表明两种有效成分的浸出动力学据符合Fick第二定律导出的浸出数学模型,模型拟合得到salidroside和rosavin内扩散传质系数分别为0.75×10-9（m2/s）和0.41×10-9（m2/s）;提取是一个吸热熵增过程,同时也是一个自发过程。2.利用静态吸附和动态解吸实验,通过比较不同树脂的吸附-解吸特性和分离选择性选出最适合分离纯化两主要活性成分的非极性树脂HPD-200,两成分在该树脂上的平衡吸附行为符合Langmuir模型。同时研究了HPD-200树脂上吸附动力学和吸附热力学,准一级、准二级反应模型和膜扩散传质模型用来拟合实验数据,结果吸附动力学可以用准二级动力学方程来描述;吸附过程是受膜扩散和内扩散步骤共同控制;吸附为放热、自发过程,升高温度不利于吸附反应的进行。此外,通过动态吸附和解吸实验,确定了最佳分离纯化工艺条件为:吸附:加样浓度为1.89mg/mL（salidroside）和0.24mg/mL （rosavin）,加样量6.4 mL（样品溶液）/g（干树脂）,柱床高度30cm,温度25℃,流速1BV/h;解吸:温度25℃,流速1BV/h,梯度洗脱的乙醇浓度和体积依次为:5%乙醇（2.5BV）、10%乙醇（2.5BV）、30%乙醇（2.5BV）、40%乙醇（2.5BV）、60%乙醇（2BV）。在最佳条件下,经过两次柱色谱分离,salidroside纯度从粗提物中的5.57%达到91.21%,总回收率48.82%;rosavin纯度从0.69%增加为15.37%,总回收率46.52%。在最佳分离条件下,进行了柱层析放大实验,结果salidroside和rosavin纯度分别为90.36%和16.02%,总回收率分别为44.75%和52.02%。3.对放大分离得到的粗salidroside进行结晶纯化,得到结晶的最佳工艺条件为:结晶溶剂乙醇,结晶溶液的浓度20.5mg/mL（w/v）,结晶温度15℃,结晶时间16h。经过一步结晶,可以得到纯度为99.18%的salidroside单体。对放大分离得到的粗rosavin先后经过硅胶柱吸附和ADS-5C反相色谱方法来制备高纯度rosavin单体。确定了两步分离过程的最佳工艺条件。硅胶柱吸附色谱最佳工艺条件为:硅胶粒度200-300目,柱床高度25cm,加样量50 mg（粗rosavin）/g （硅胶）,流动相氯仿-甲醇（4:1,v/v）,流速l.5 mL/min,洗脱体积3BV。rosavin纯度从16.02%增加到50.17%、回收率为82.46%。ADS-5c反相色谱的最佳佳工艺条件为:加样量16.7 mg（样品）/g （树脂）,洗脱剂50%乙醇,洗脱流速2BV/h,纯度最高可以达到98.73%,回收率为43.29%。此外,结合硅胶柱层析和制备反相HPLC方法,对大孔树脂分离salidroside和rosavin得到的其它馏分进行分离纯化,制备得到了19个单体化合物。4.通过UV、ESI-MS、1H-NMR 13C-NMR、DEPT-135和二维谱（1H-1H-COSY、HMQC、HMBC）等现代波谱分析方法,对其中15个单体化合物进行了结构鉴定,15个化合物分别鉴定为对-O-β-吡喃葡萄糖基-苯-2-丁酮, 6’-O-没食子酰-红景天苷,对-O-β-吡喃葡萄糖基-苯丙烯酸,7-甲氧基香豆素,苯乙基-6-O-β-葡萄糖苷,对羟基苯甲酸,红景天苷,肉桂醇-6‘-O-α-吡喃阿拉伯糖基-O-β-吡喃葡萄弹苷,肉桂醇-6’-O-α-吡喃木糖-O-β-吡喃葡萄弹苷,肉桂醇-6’-O-α-呋喃阿拉伯糖基-O-β-吡喃葡萄弹苷,肉桂醇-6-O-β-吡喃葡萄弹苷,对-羟基-苯乙醇,3, 7-二甲基-2, 6-二烯-1, 4-二辛醇,3, 7-二甲基-2, 6-二烯-1, 4-二辛醇-β-吡喃葡萄糖苷。其中,对-O-β-吡喃葡萄糖基-苯-2-丁酮,6’-O-没食子酰-红景天苷,对-O-β-吡喃葡萄糖基-苯丙烯酸、7-甲氧基香豆素为首次从玫瑰红景天分到的化合物。5.通过最佳化提取、分离、分析条件,建立了一种HPLC方法同时测定红景天中六种“适应原”活性成分,色谱条件为:色谱柱Purospher STAR C18;流动相甲醇（A）+ pH 5.6 20mmol/L乙酸铵水溶液（B）;梯度程序40分钟内流动相由10A/90B变为100A/0B;流速1mL/min;柱温30℃;检测器二极管阵列（DAD）,检测波长分别为276,250 and 205nm。该方法有好的线性,令人满意的精密度和回收率。然后新形成的方法用来分析不同品种不同产地的红景天样品,结果红景天样品中六种有效成分的含量范围分别为salidroside 0.16-11.14 mg/g;tyrosol 0-2.89 mg/g;rosarin 0-1.01 mg/g;rosavin 0-6.78 mg/g;rosin 0-1.51 mg/g;rosiridin 0-7.89 mg/g。六种成分的总量范围为1.3-12.88 mg/g。不同品种和产地的红景天样品所含六种适应源活性成分的种类和含量不同。新形成的方法也用来建立玫瑰红景天、狭叶红景天和高山红景天的HPLC指纹图谱,得到了19个共有峰,利用HPLC-MS方法对19个共有峰的分子量进行确证,其中,根据HPLC-MS提供的特征紫外光谱、分子量信息和一些结构方面的信息,有10个成分被鉴定。对指纹图谱进行相似度、聚类和主成分分析,结果表明同种红景天样品有好的相似性、不同品种间有较大的差异,指纹图谱可以区别不同品种的红景天。

论文目录

  • 中文摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 绪论
  • 1.1 玫瑰红景天简介
  • 1.1.1 形态与分类
  • 1.1.2 应用史
  • 1.2 玫瑰红景天的化学成分
  • 1.2.1 主要成分
  • 1.2.1.1 苯乙醇类化合物（phenylethanoids）
  • 1.2.1.2 黄酮类（flavonoids）
  • 1.2.1.3 苯丙素（phenylpropanoids）
  • 1.2.1.4 萜类（terpenes）
  • 1.2.1.5 生氰苷
  • 1.2.1.6 有机酸类（organic acids）
  • 1.2.1.7 其它成分
  • 1.2.2 活性成分的生源合成途径
  • 1.2.3 活性成分的生物转化、遗传工程和组织培养
  • 1.2.4 活性成分的人工合成
  • 1.3 玫瑰红景天的生物活性
  • 1.3.1 适应原和抗压效果
  • 1.3.2 对脑力劳动和体力劳动的影响
  • 1.3.3 抗抑郁和抗焦虑活性
  • 1.3.4 对学习和记忆的影响
  • 1.3.5 抗氧化、抗变异和抗癌效果
  • 1.3.6 对肝和心脏保护作用
  • 1.3.7 对内分泌和生殖的作用
  • 1.3.8 毒性、适用人群、剂量
  • 1.4 有效成分的提取方法
  • 1.4.1 回流提取
  • 1.4.2 微波辅助提取
  • 1.4.3 超声辅助提取
  • 1.4.4 酶解法
  • 1.4.5 超临界流体萃取
  • 1.4.6 超高压提取
  • 1.5 有效成分的分离纯化方法
  • 1.6 有效成分的检测方法
  • 1.6.1 气相色谱质谱联用（GC-MS）
  • 1.6.2 毛细管电泳色谱（CEC）
  • 1.6.3 薄层色谱
  • 1.6.4 高效液相色谱（HPLC）
  • 1.7 立题的目的和意义
  • 1.8 研究的内容
  • 参考文献
  • 第二章 玫瑰红景天有效成分提取工艺
  • 2.1 引言
  • 2.2 材料与方法
  • 2.2.1 材料和试剂
  • 2.2.2 实验仪器
  • 2.2.3 有效成分提取率的测定方法
  • 2.2.4 固形物提取率测定方法
  • 2.2.5 原料粒径的计算方法
  • 2.2.6 提取工艺参数的选择
  • 2.2.6.1 单因素实验
  • 2.2.6.2 响应面实验优化工艺参数
  • 2.2.7 HPLC 法测定红景天浸出液
  • 2.2.8 提取过程的动力学模型
  • 2.2.9 提取过程的热力学
  • 2.3 结果与讨论
  • 2.3.1 有效成分提取工艺单因素实验
  • 2.3.1.1 提取方法对提取率的影响
  • 2.3.1.2 乙醇浓度对提取率的影响
  • 2.3.1.3 液料比对提取率的影响
  • 2.3.1.4 温度对提取率的影响
  • 2.3.1.5 提取时间对提取率的影响
  • 2.3.2 有效成分提取工艺参数的优化
  • 2.3.2.1 正交组合实验方案的按排
  • 2.3.2.2 响应面模型回归系数分析
  • 2.3.2.3 响应面各实验因素对提取得率的影响
  • 2.3.2.4 提取条件的最佳化
  • 2.3.3 提取次数的确定
  • 2.3.4 提取过程的动力学模型
  • 2.3.5 提取平衡常数与摩尔吉布斯自由能变化
  • 0和ΔS0'>2.3.6 提取的热力学参数ΔH0和ΔS0
  • 2.4 本章小结
  • 参考文献
  • 第三章 有效成分的分离纯化
  • 3.1 引言
  • 3.2 材料和仪器
  • 3.2.1 材料和试剂
  • 3.2.2 主要仪器与设备
  • 3.3 实验方法
  • 3.3.1 大孔树脂对两种主要有效成分的分离和富集
  • 3.3.1.1 大孔树脂的预处理和再生
  • 3.3.1.2 样品的制备
  • 3.3.1.3 静态吸附和解吸
  • 3.3.1.4 静态吸附等温线
  • 3.3.1.5 静态吸附动力学
  • 3.3.1.6 动态吸附和解析
  • 3.3.2 Salidroside 单体结晶制备分离
  • 3.3.3 Rosavin 粗品硅胶柱层析
  • 3.3.4 ADS-5c 树脂柱层析制备rosavin 单体
  • 3.3.4.1 静态吸附等温线
  • 3.3.4.2 动态吸附和洗脱
  • 3.3.5 其它单体的制备纯化
  • 3.3.5.1 10%乙醇洗脱物的分离
  • 3.3.5.2 30%乙醇洗脱物的分离
  • 3.3.5.3 40%乙醇洗脱物的分离
  • 3.3.5.4 60%乙醇洗脱物的分离
  • 3.4 结果和讨论
  • 3.4.1 大孔树脂对两种主要有效成分的分离和富集
  • 3.4.1.1 吸附树脂的选择
  • 3.4.1.2 树脂静态吸附等温线
  • 3.4.1.3 三种树脂静态吸附吸附动力学方程
  • 3.4.1.4 三种非极性树脂对两类成分的分离选择性
  • 3.4.1.5 树脂静态吸附机理
  • 3.4.1.6 HPD-200 树脂静态吸附等温线
  • 3.4.1.7 树脂静态吸附热力学
  • 3.4.1.8 动态吸附和分离
  • 3.4.2 Salidroside 单体结晶制备分离
  • 3.4.2.1 Salidroside 浓度对结晶的影响
  • 3.4.2.2 时间对salidroside 结晶的影响
  • 3.4.2.3 温度对salidroside 结晶的影响
  • 3.4.2.4 在优化条件下的结晶纯化效果
  • 3.4.2.5 硅胶柱色谱流动相的选择
  • 3.4.3 Rosavin 粗品硅胶柱层析
  • 3.4.3.1 硅胶柱色谱加样量的选择
  • 3.4.3.2 柱床高度的选择
  • 3.4.3.3 硅胶柱色谱洗脱流速的选择
  • 3.4.3.4 硅胶柱对rosavin 的分离效果
  • 3.4.4 ADS-5c 树脂柱层析制备rosavin 单体
  • 3.4.4.1 ADS-5c 树脂的静态吸附等温线
  • 3.4.4.2 洗脱剂的选择
  • 3.4.4.3 洗脱流速的选择
  • 3.4.4.4 ADS-5c 对rosavin 的分离纯化结果
  • 3.4.5 其它单体的制备纯化
  • 3.5 本章小结
  • 参考文献
  • 第四章 有效成分的结构鉴定
  • 4.1 引言
  • 4.2 实验部分
  • 4.2.1 材料与试剂
  • 4.2.2 实验仪器
  • 4.2.3 实验方法
  • 4.2.3.1 红外光谱法（IR）
  • 4.2.3.2 高效液相色谱色谱-电喷雾质谱（HPLC-ESI-MS）
  • 4.2.3.3 核磁共振法
  • 4.3 结果与讨论
  • 4.3.1 化合物1 结构鉴定
  • 4.3.2 化合物2 结构鉴定
  • 4.3.3 化合物3 的结构鉴定
  • 4.3.4 化合物4 的结构鉴定
  • 4.3.5 化合物5 的结构鉴定
  • 4.3.6 化合物6 的结构鉴定
  • 4.3.7 化合物7 的结构鉴定
  • 4.3.8 Salidroside 的波谱分析
  • 4.3.9 Rosavin 的波谱分析
  • 4.3.10 化合物8 结构鉴定
  • 4.3.11 化合物9 结构鉴定
  • 4.3.12 化合物10 结构鉴定
  • 4.3.13 化合物11 结构鉴定
  • 4.3.14 化合物12 结构鉴定
  • 4.3.15 化合物13 结构鉴定
  • 4.4 本章小结
  • 参考文献
  • 第五章 红景天有效成分分析及指纹图谱的建立
  • 5.1 引言
  • 5.2 材料和仪器
  • 5.2.1 实验仪器
  • 5.2.2 材料与试剂
  • 5.3 实验方法
  • 5.3.1 主要成分的定量分析
  • 5.3.1.1 主要成分含量计算
  • 5.3.1.2 标准溶液的配制
  • 5.3.1.3 样品的制备
  • 5.3.1.4 色谱条件
  • 5.3.2 红景天指纹图谱分析
  • 5.3.2.1 样品的制备
  • 5.3.2.2 色谱条件
  • 5.4 结果与讨论
  • 5.4.1 主要成分的定量分析
  • 5.4.1.1 色谱条件的优化
  • 5.4.1.2 检测波长的选择
  • 5.4.1.3 溶剂提取方法的优化
  • 5.4.1.4 HPLC 定量方法的确证
  • 5.4.1.5 红景天样品多成分含量的测定
  • 5.4.2 不同产地和品种的红景天指纹图谱分析
  • 5.4.2.1 精密度和重现性
  • 5.4.2.2 稳定性实验
  • 5.4.2.3 测定波长的选择
  • 5.4.2.4 不同产地和品种的红景天指纹图谱的建立
  • 5.4.2.5 指纹图谱相似度分析
  • 5.4.2.6 红景天样品指纹图谱的聚类分析
  • 5.4.2.7 红景天样品指纹图谱的主成分分析
  • 5.4.2.8 指纹图谱中化学成分的鉴定
  • 5.5 本章小结
  • 参考文献
  • 主要结论
  • 主要创新点
  • 致谢
  • 攻读博士学位期间发表的论文
  • 附录

    • 相关论文文献

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