乳腺癌易感基因BRCA1沉默与散发性乳腺癌发病相关性的研究

论文摘要

目的乳腺癌是严重威胁女性健康的恶性肿瘤之一，乳腺癌分为遗传型和散发型，遗传型约占5％，大部分（95％）是散发性乳腺癌。而80％家族遗传性乳腺癌和卵巢癌患者携带乳腺癌易感基因BRCA1突变。在散发性乳腺癌组织中很少检测到BRCA1基因突变，但有BRCA1 mRNA水平的降低和蛋白低表达，其机制还不清楚。随着对表观遗传机制的认识，有研究认为BRCA1基因启动子甲基化是导致BRCA1蛋白低表达的原因之一。本研究拟检测较大样本的乳腺组织中，乳腺癌易感基因BRCA1启动子CpG区甲基化状态，结合BRCA1蛋白的表达情况，探讨乳腺癌易感基因BRCA1在散发性乳腺癌中沉默的机制；检测BRCA1基因在非癌性乳腺组织、BRCA1启动子甲基化和非甲基化的乳腺癌组织中的拷贝数，探讨BRCA1基因启动子甲基化与BRCA1基因位点缺失的关系，散发性乳腺癌的发病机制。方法免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）SP法检测98例散发性乳腺癌和12例非癌性乳腺组织石蜡标本BRCA1蛋白的表达情况。并分析BRCA1蛋白表达与临床病理学参数（患者年龄、乳腺癌病理类型、病理组织学分级、淋巴结的转移、雌、孕激素受体水平），及与其他抑癌基因和癌基因（p53、C-myc、bcl-2和HER-2）蛋白表达之间的关系。甲基化特异性PCR技术（methylation specific PCR，MSP）检测98例乳腺癌和12例非癌性乳腺组织的冰冻标本BRCA1启动子区CpG岛甲基化水平，结合BRCA1蛋白表达情况，分析BRCA1启动子甲基化与BRCA1蛋白表达、临床病理指标和相关调控蛋白表达间的关系。采用间期核双色荧光免疫原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）技术，检测在非癌性乳腺组织、BRCA1基因启动子甲基化和非BRCA1甲基化的散发性乳腺癌组织中BRCA1基因和17号染色体着丝粒（CEP17）在17号染色体的拷贝数，计算拷贝的平均值和BRCA1／CEP17的比率，分析BRCA1启动子甲基化与BRCA1基因拷贝数之间的关系。结果一、BRCA1蛋白在乳腺组织中的表达：免疫组织化学检测结果表明，BRCA1蛋白在非癌性乳腺组织中的细胞核阳性表达率为100％（12／12），未见细胞浆表达；在散发性乳腺癌组织中，BRCA1在细胞浆和细胞核均见表达，BRCA1在细胞核的阳性表达率为53.1％（52／98）。二、散发性乳腺癌组织中BRCA1表达与临床病理指标的相关性：免疫组化学检测显示，乳腺癌组织学分级Ⅰ级为29例（29.6％），Ⅱ级为42例（42.9％），Ⅲ级为27例（27.5％）。BRCA1蛋白表达阳性率在组织学分级Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中分别为72.4％（21／29）、50.0％（21／42）和37.0％（10／27）；其中BRCA1蛋白中度表达，在组织学分级Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中分别占27.6％（8／29）、4.8％（2／42）和0.0％（0／27）；低度表达在各组织分级比率分别为44.8％（13／29）、45.2％（19／42）和37.0％（10／27）；BRCA1蛋白表达阴性率分别为27.6％（8／29）、50.0％（21／42）和63.0％（17／27）。组织学分级Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中BRCA1蛋白阳性表达在细胞核的比率分别为55.2％（16／29）、40.5％（17／42）和11.1％（3／27）。BRCA1蛋白阳性表达率与组织学分级呈负相关（P＜0.01），组织学分级越高，BRCA1蛋白表达越少。病例中腋淋巴结转移45例（45.9％），无转移53例（54.1％）。BRCA1蛋白中度表达的腋淋巴结转移率10％（1／10），低度表达的转移率38.1％（16／42），BRCA1蛋白表达阴性的腋淋巴结转移率为60.9％（28／46）。BRCA1蛋白在细胞核阳性表达伴有腋淋巴结转移的为19.4％（7／36），无淋巴结转移的为80.6％（29／36）。BRCA1蛋白细胞核阳性表达与腋淋巴结转移呈负相关（P＜0.01）。BRCA1蛋白表达与散发性乳腺癌雌激素受体（ER）和孕激素受体（PR）蛋白表达之间无显著相关性。三、散发性乳腺癌组织中BRCA1表达与相关调控基因蛋白表达的相关性：HER-2低表达的乳腺癌BRCA1细胞核表达阳性率为45.2％（14／31），HER-2中、高度表达的乳腺癌组织BRCA1细胞核表达阳性率为11.1％（1／9）和0.0％（0／5），BRCA1细胞核表达阴性的乳腺癌组织HER-2表达增高（P＜0.05）。其他相关调控蛋白（p53、bcl-2和C-myc）在BRCA1表达阴性的乳腺癌组织中，阳性表达率普遍高于BRCA1中度表达的乳腺癌组织，但无差异显著性。四、乳腺组织中BRCA1启动子甲基化检测：应用MSP方法检测了12例非癌性乳腺组织和98例散发性乳腺癌组织BRCA1基因启动子甲基化水平，在12例非癌性乳腺组织中，未检测到BRCA1启动子CpG区甲基化；在98例散发性乳腺癌组织中，检测到15例BRCA1启动子CpG区异常甲基化，占所检测散发性乳腺癌病例的15.3％（15／98）。五、BRCA1启动子甲基化与BRCA1蛋白及相关调控基因蛋白表达的相关性：MSP检测的98例散发性乳腺癌中，15例BRCA1启动子CpG区异常甲基化，结合免疫组化结果，该15例的细胞核BRCA1蛋白表达均为阴性，占BRCA1蛋白表达阴性病例的32.6％（15／46）。BRCA1启动子甲基化与BRCA1蛋白细胞核阴性表达密切相关（P＜0.01）。BRCA1启动子甲基化与相关调控蛋白bcl-2、p53、HER-2和c-myc表达之间，未见明显相关性。六、BRCA1基因启动子甲基化与乳腺癌临床病理指标的相关性：病理组织学分级Ⅰ级的乳腺癌组织，3.4％的病例检测到BRCA1启动子甲基化；而病理组织学分级Ⅲ级的乳腺癌，29.6％的病例检测到BRCA1启动子甲基化，差异性显著（P＜0.05）。淋巴结转移的散发性乳腺癌组织，24.4％（11／45）的病例BRCA1启动子甲基化，明显高于无淋巴结转移的乳腺癌组织中7.5％（4／53）的BRCA1启动子甲基化比率，差异性显著（P＜0.05）。七、BRCCA1拷贝数与BRCA1启动子甲基化的相关性：双色FISH检测非癌性乳腺组织3例、BRCA1启动子甲基化乳腺癌12和非甲基化的散发性乳腺癌组织5例的BRCA1基因拷贝，计数均值和BRCA1单拷贝和多拷贝所占比例。非癌性乳腺组织中，BRCA1基因平均拷贝数为2.05±0.09；BRCA1启动子甲基化的乳腺癌BRCA1基因平均拷贝数为1.41±0.18，低于非甲基化的散发性乳腺癌组织的BRCA1平均拷贝数1.98±0.09，差异显著（P＜0.05）。BRCA1启动子甲基化的乳腺癌BRCA1单拷贝比例为（22.04±1.06）％，高于BRCA1启动子非甲基化乳腺癌BRCA1单拷贝比例（2.56±0.32）％、非癌性乳腺组织中BRCA1单拷贝比率（0.84±0.03）％，差异性显著（P＜0.01）。BRCA1启动子非甲基化乳腺癌BRCA1基因多拷贝间期核的比例为（20.86±1.92）％，明显高于BRCA1启动子甲基化乳腺癌中（1.47±0.20）％的比例、非癌性乳腺组织中BRCA1多拷贝比率（1.12±0.08）％之间，有显著性差异（P＜0.01）。BRCA1启动子甲基化乳腺癌BRCA1基因平均拷贝数减少，单拷贝比率增加。八、BRCA1／CEP17拷贝数比率与BRCA1启动子甲基化的相关性：双色FISH检测乳腺非癌性组织、BRCA1启动子甲基化和非甲基化的散发性乳腺癌组织中CEP17拷贝，计算平均值和BRCA1／CEP17的平均拷贝比率。非癌性乳腺组织中，CEP17的平均拷贝数为2.33±0.17；BRCA1启动子甲基化的散发性乳腺癌组织中CEP17平均拷贝数为1.92±0.19，低于非甲基化乳腺癌中平均拷贝数2.39±0.46，但没有差异显著性。BRCA1启动子甲基化的乳腺癌CEP17单拷贝的比例为（24.60±2.09）％，高于BRCA1启动子非甲基化乳腺癌CEP17单拷贝的比例（3.31±0.23）％、非癌性乳腺组织中CEP17单拷贝比率（1.04±0.07）％，差异性显著（P＜0.01）。BRCA1启动子非甲基化乳腺癌CEP17多拷贝间期核的比例为（23.2±1.98）％，明显高于BRCA1启动子甲基化乳腺癌中（2.02±0.22）％的比例，非癌性乳腺组织中CEP17多拷贝比率（1.46±0.11）％，有显著性差异（P＜0.01）。BRCA1／CEP17比率在BRCA1启动子甲基化乳腺癌中平均为0.74±0.11，与非甲基化乳腺癌中的平均值0.85±0.13、非癌性乳腺组织中BRCA1／CEP17比率的均值0.88±0.05之间，无差异显著性。结论一、BRCA1蛋白在非癌性乳腺组织中均为细胞核阳性表达；在散发性乳腺癌组织中细胞核阳性表达下降，且与散发性乳腺癌的病理组织学分级、腋淋巴结转移、HER-2异常扩增等指标呈负相关。‘二、散发性乳腺癌组织中，BRCA1启动子甲基化与蛋白低表达密切相关，可能机制为BRCA1启动子甲基化导致BRCA1和CEP17拷贝缺失所致。

论文目录

• 一、摘要
• 1.中文论著摘要
• 2.英文论著摘要
• 二、英文缩略语
• 三、论文
• 论文一 乳腺组织中BRCA1蛋白表达与相关影响因素的研究
• 1.前言
• 2.方法
• 3.结果（附论文图片）
• 4.讨论
• 5.结论
• 6.参考文献
• 论文二 散发性乳腺癌中BRCA1基因启动子甲基化与蛋白表达相关性的研究
• 1.前言
• 2.材料与方法
• 3.结果（附论文图片）
• 4.讨论
• 5.结论
• 6.参考文献
• 论文三 散发性乳腺癌BRCA1启动子甲基化与BRCA1基因拷贝信号的相关性
• 1.前言
• 2.方法
• 3.结果（附论文图片）
• 4.讨论
• 5.结论
• 6.参考文献
• 四、本研究创新性的自我评价
• 五、附录
• 1.综述
• 2.在学期间科研成绩
• 3.致谢
• 4.个人简介