论文题目: 阿维菌素类药物多残留分析方法的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 基础兽医学
作者: 何继红
导师: 沈建忠
关键词: 阿维菌素类药物,残留分析,免疫亲和色谱柱,高效液相色谱
文献来源: 中国农业大学
发表年度: 2005
论文摘要: 阿维菌素类药物（Avermectins, AVMs）属于大环内酯类抗生素,由于其优良的驱虫活性而广泛应用于畜牧业。然而作为高毒化合物,AVMs在动物组织中的残留不容忽视。本研究旨在制备针对AVMs的抗体,以此为核心试剂建立检测动物组织中AVMs残留的ELISA快速筛选方法和免疫亲和色谱-高效液相-荧光检测（IAC-HPLC-FLD）技术。 将阿维菌素（Avermectin, AVM）、伊维菌素（Ivermectin, IVM）和多拉菌素（Doramectin, DOR）进行结构改造,制备半抗原4"-o-succinoylAVM、4"-o-succinoyl IVM和4"-o-succinoyl DOR。质谱鉴定其分子量为995.7（M+Na+）、997.8（M+Na+）和998.6（M-H+）,与目标产物分子量一致。将半抗原与载体蛋白BSA偶联,制备免疫抗原,免疫动物制备抗体。半抗原与OVA偶联,制备包被抗原。免疫抗原与包被抗原紫外扫描光谱鉴定,载体蛋白与半抗原的结合比1:3.4-1:31.6。 筛选出的抗AVM的多克隆抗体对AVMs有较高的交叉反应:埃普里诺菌素（Eprinomectin, EP）为145.4%、AVM为100%、IVM为25.0%、DOR为12.3%。以此抗体为基础建立ELISA检测方法,可同时检测牛组织中的AVM、IVM和EP残留。确定包被抗原的包被浓度为1:5000,抗体的工作浓度为1:5000,酶标二抗的工作浓度为1:2000。标准曲线:y=-45.613x+81.191,R2=0.9951,IC50=4.8ng/mL,线性范围为1.1-21.9ng/mL。空白牛肝脏组织中以20、50和100ng/g浓度添加时,AVMs回收率为53.8-80.4%,变异系数为3.4-17.9%;空白牛肌肉组织中以5、10和20ng/g浓度添加时,AVMs回收率为70.9-108.6%,变异系数为3.7-17.1%。 国内外率先研制出可同时检测牛肝脏和牛肌肉组织中的AVM、IVM和EP残留的ELISA试剂盒。本研究对试剂盒的各溶液配方进行选择,并确定试剂盒的技术参数:试剂盒的灵敏度(IC50)为3.0-7.0ng/mL,空白牛肝脏组织最低检测限为8.4-9.6ng/g,空白牛肌肉组织最低检测限为0.5-0.8ng/g。该试剂盒中抗体对AVM、IVM、EP和DOR的交叉反应率分别为100%、25.0%、145.4%和12.3%。试剂盒的准确度和精密度实验符合要求,试剂盒的保存实验证明,该试剂盒可在2-8℃保存6个月。 国内外率先制备了可同时检测AVM、IVM、DOR和EP残留的高容量的IAC柱,AVM、IVM、DOR和EP的动态柱容量分别为3531、3542、3543和3284ng/mL gel,绝对柱容量分别为495、499、493和460ng/mg IgG。IAC柱在一个月的时间内重复使用15次后,AVMs的动态柱容量仍能达到1300ng/mL gel。 建立了IAC-HPLC-FLD检测方法,可同时检测动物组织中的AVM、IVM、EP和DOR残留。以5、10、50和100ng/g的浓度水平添加时,空白牛肝脏组织4种药物添加回收率为79.4-113.8%,变异系数为1.1-19.4%;牛肌肉组织中4种添加药物回收率为77.3-119.5%,变异系数为1.5-18.9%。方法的检测限为0.8ng╱g。
论文目录:
中文摘要
Abstract
缩略语表
第一章 绪论
1 研究的目的和意义
2 国内外研究现状
2.1 AVMs研究概况
2.2 AVMs残留检测方法研究进展
3 研究的内容和方法
3.1 研究内容
3.2 研究方法
第二章 半抗原的合成及抗体的制备
1 材料与方法
1.1 材料
1.2 试验方法
2 结果与分析
2.1 半抗原的合成与鉴定
2.2 完全抗原的合成与鉴定
2.3 多克隆抗体的制备
3 讨论
3.1 半抗原的合成与鉴定
3.2 完全抗原的制备与鉴定
3.3 抗体的制备与鉴定
3.4 ELISA检测方法的建立
第三章 AVMs残留检测的ELISA试剂盒的研制
1 材料与方法
1.1 材料
1.2 方法
2 结果与分析
2.1 试剂盒中试剂的配方确定
2.2 包被时间的确定
2.3 封闭时间的确定
2.4 AVM与抗体体积比的选择
2.5 竞争反应时间的确定
2.6 显色时间的确定
2.7 pH值的确定
2.8 盐浓度的确定
2.9 有机溶剂的确定
2.10 选定条件的综合确定
2.11 试剂盒灵敏度的确定
2.12 试剂盒特异性的确定
2.13 试剂盒精密度的测定
2.14 试剂盒准确度的测定
2.15 与国外试剂盒的比较
2.16 试剂盒的保存实验
3 讨论
3.1 ELISA试剂盒条件的优化
3.2 试剂盒技术参数的确定
3.3 与国外试剂盒的比较
第四章 IAC-HPLC-FLD检测方法的研究
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.2 方法
2 结果与分析
2.1 偶联率的测定
2.2 柱容量的测定
2.3 AVMs的添加回收以及洗脱柱型图
2.4 柱容量的重复使用及保存实验
2.5 添加回收实验
3 讨论
3.1 IAC柱的制备
3.2 柱容量
3.3 添加回收实验
结论
参考文献
致谢
附录
作者简介
发布时间: 2005-07-18
参考文献
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