中国林蛙抗菌肽分离鉴定、cDNA克隆及其原核表达载体的构建

论文摘要

背景与目的：抗菌肽（antibacterial peptides）又叫抗微生物肽（antimicrobial peptides），肽抗生素（peptide antibiotics），是由10-50个氨基酸残基组成，常带正电荷，并具有广谱抗菌活性的小肽，是生物先天免疫系统的重要组成部分。两栖动物皮肤裸露、潮湿，这无疑给微生物提供了一个极好的生存环境。但在长期的自然选择过程中，它们逐渐形成了防御机制，即由背部及腹部皮肤的分泌抗菌类物质来抵御有害环境因子的侵袭。蛙类皮肤生物活性肽是抗菌肽家族的重要成员，其不但种类繁多，而且数量庞大。通过结构与同源性分析表明这些抗菌肽属于Magainin、Bombinin、Bombinin-like、Brevinin、Esculentin、Ranatuerin、Temporin、Ranalexin、Aurein、Caerin和Citropin等抗菌肽家族。两栖类抗菌肽具有高效、广谱的抗菌作用，且不易产生耐药性等特点，其这些特性激起了人们极大的兴趣，在耐抗生素病原菌株不断出现的今天，抗菌肽有望成为新一代的临床抗菌药物。本研究已成功克隆中国林蛙抗菌肽基因全长cDNA序列，在GenBanK中进行登录（登录号：DQ673105），并采用生物信息学的方法对核酸序列以及氨基酸序列进行分析，进而对蛋白的结构和功能进行预测、分析，为中国林蛙抗菌肽分子生物学水平研究奠定了基础。同时，将编码成熟抗菌肽基因序列亚克隆至原核表达载体PGEX-3X中，构建重组表达质粒进行IPTG诱导表达。方法：（1）利用反相高效液相色谱（reverse phase high performance liquid chromatography RP—HPLC）和质谱（mass spectrometry）检测技术对中国林蛙皮肤分泌物中抗菌肽进行分离纯化和分析，并以革兰氏阴性菌大肠埃希氏杆菌（G-E.coli）和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌（G+ S.aureus）为测试菌株，通过琼脂扩散法对分离出的多肽进行抑菌活性测定。应用Edman降解法对有抑菌活性的多肽物质进行结构鉴定。（2）以N末端氨基酸测序结果（MFTMKKSMLL-）为递交序列，结合NCBI中blastn比对结果设计蛙属抗菌肽简并引物。（3）采用异硫氰酸胍法在无RNase的环境条件下制备中国林蛙皮肤组织总RNA。（4）以提取的中国林蛙皮肤总RNA。为模板，采用3’RACE（Rapid Amplification Of cDNA Ends）技术进行中国林蛙抗菌肽基因的cDNA克隆，测序分析。同时，运用生物信息学软件对其全长cDNA序列进行阅读框架、同源性比较和相关的生物学功能分析。（5）根据cDNA克隆所获得的中国林蛙抗菌肽基因中编码成熟肽的序列设计合成引物，以全长cDNA序列为模板，通过PCR扩增，获得带有限制性酶切位点的目的片段。（6）采用T／A克隆法将目的序列插入pMD18-T simple克隆载体，测序，正确后将酶切的目的序列亚克隆至经相应限制性内切酶消化处理的原核表达载体pGEX-3X上，构建原核重组表达载体。将重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中，用IPTG进行诱导表达，采用SDS-PAGE电泳进行分析检测。结果：（1）应用RACE技术成功的获得了一条中国林蛙抗菌肽基因的全长cDNA序列。序列全长为297bp，其中包括213bp完整的开放阅读框（open reading frame ORF），含有84bp的3’非转译区（3’UTR），推测编码71个氨基酸的多肽，分子量（MW）为7810.9Da，等电点（pI）为5.08。经生物信息学分析表明，中国林蛙CAMPs-3氨基酸序列N末端均含有一个相对保守的由22个氨基酸组成的信号肽（signle peptide）序列，还包含有一个拷贝由个33氨基酸组成的成熟肽（mature peptide），在信号肽和成熟体之间，是一段富含酸性氨基酸的酸性间隔序列（acidic spacer domain）。经同源性分析，在氨基酸水平的同源性高于核苷酸水平的同源性，该序列已被GenBanK收录，登录号为DQ673105。（2）将编码成熟肽的目的序列亚克隆至pMD18-T simple克隆载体中，经测序显示其编码氨基酸序列与原始序列完全一致。将酶切后的目的序列插入PGEX-3X原核表达载体中构建重组表达质粒pGEX-chensirin-3，经IPTG诱导后，表达出相对分子质量为30kDa的GST融合蛋白。结论：（1）从中国林蛙皮肤组织中分离出一条新的编码抗菌肽前体CAMPs-3的全长cDNA序列，经NCBI网站中的blastp服务器分析发现与ranatuerin和brevinin家族抗菌肽具有较高的同源性，分别为90％-72％，70％-53％。（2）成功的构建重组融合蛋白表达质粒pGEX-chensirin-3，经诱导，表达出分子量为30kDa融合蛋白。为进一步研究两栖类抗菌肽的抑菌机制及高效表达奠定了基础。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 1 抗菌肽简介
• 2 两栖类抗菌肽的研究概况
• 2.1 两栖动物皮肤
• 2.2 两栖动物抗菌肽发现和分离
• 2.3 两栖类抗菌肽的种类
• 2.4 两栖类抗菌肽的分子结构
• 2.5 两栖类抗菌肽的生物学功能
• 2.6 两栖类抗菌肽的应用
• 2.7 两栖类抗菌肽的基因工程研究
• 3 本研究的内容和意义
• 第一部分 中国林蛙抗菌肽的分离纯化、结构鉴定及cDNA克隆
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.2.1 中国林蛙皮肤分泌物的收集
• 2.2.2 中国林蛙抗菌肽的分离纯化
• 2.2.3 中国林蛙抗菌肽抑菌活性鉴定
• 2.2.4 中国林蛙抗菌肽结构的鉴定
• 2.2.5 引物的设计与合成
• 2.2.6 中国林蛙皮肤总RNA的提取
• 2.2.7 中国林蛙抗菌肽基因cDNA克隆
• 2.2.8 PCR产物的回收
• 2.2.9 目的片段与克隆载体的连接
• 2.2.10 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.11 重组质粒的转化
• 2.2.12 阳性克隆的筛选
• 2.2.13 重组质粒的鉴定
• 2.2.14 生物信息学分析
• 3 结果
• 3.1 中国林蛙抗菌肽的分离纯化
• 3.2 中国林蛙抗菌肽抑菌活性的测定
• 3.3 中国林蛙抗菌肽结构分析
• 3.4 皮肤组织总RNA的提取
• 3.5 中国林蛙抗菌肽基因的克隆
• 3.6 重组克隆载体pMD-18T-CAMPs-3的PCR和酶切鉴定
• 3.7 序列测定和生物信息学分析
• 4 讨论
• 5 小结
• 第二部分 抗菌肽基因原核表达载体的构建与筛选
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.2.1 引物的设计与合成
• 2.2.2 目的基因的扩增与回收
• 2.2.3 chensirin-3成熟肽基因的TA克隆和序列测定
• 2.2.4 融合表达质粒的构建
• 2.2.5 GST-CAMP3重组蛋白的诱导表达
• 3 结果
• 3.1 引物的设计及中国林蛙成熟肽基因chensirin-3扩增
• 3.2 抗菌肽chensirin-3基因的T/A克隆
• 3.3 原核融合蛋白表达载体的构建
• 3.4 融合蛋白的诱导表达
• 4 讨论
• 5 小结
• 参考文献
• 缩略词英汉对照表
• 致谢
• 作者简介