苏云金芽胞杆菌中双组分信号转导系统的研究

2020-12-11阅读(313)

论文摘要

苏云金芽胞杆菌是目前应用最广泛的微生物杀虫剂。它广泛存在于多种环境中,在芽胞形成期大量产生杀虫晶体蛋白并形成伴胞晶体。但苏云金芽胞杆菌对环境变化的快速适应能力和伴胞晶体形成的调控机制等方面依然不完全清楚。本文主要利用生物信息学方法对苏云金芽胞杆菌的双组分信号转导系统（Two-component signal transduction system, TCS）进行了深入分析,并选取典型的双组分YycGF及其所在的操纵子进行结构与功能研究。旨在为深入研究苏云金芽胞杆菌的生长、代谢以及毒力因子的表达与调控提供新的思路,为全面了解伴胞晶体的形成机制开辟新的研究方向。1)采用生物信息学方法,系统分析了由华中农业大学农业微生物学国家重点实验室完成全基因组测序的YBT-1520、CT-43和BMB171三个菌株的TCS。分别分析了TCS的分布、结构,并在蛋白质水平上对TCS的功能进行预测,在此基础上初步构建了苏云金芽胞杆菌中部分TCS的调控网络关系图。2)分别构建了组氨酸激酶YycG及其操纵子结构上的YycH. YycI的大肠杆菌表达载体,经诱导表达后,通过Ni-NTA和GST树脂亲和纯化获得高纯度的YycG、YycH和YycI蛋白。3)通过Pull-down技术,明确地证实YycI与YycG之间存在相互作用。同时还利用细菌双杂交技术,进一步证实了YycI和YycH与YycG之间均存在相互作用,而且YycI与YycG之间的相互作用强于YycH与YycG之间的相互作用。4)将yycF基因克隆到载体pHT1K-Plip-TS中,构建了过表达载体pHT1K-yycF,并转化到BMB171中,得到的菌株命名为BMB/F。RT-PCR检测证实,BMB/F菌株中的yycF基因转录水平比原始菌株高。SDS-PAGE结果显示,BMB/F菌株与原始菌株之间的总蛋白表达水平存在明显差异。

论文目录

摘要

Abstract

缩略语表

1 前言

1.1 苏云金芽胞杆菌简介

1.1.1 苏云金芽胞杆菌的生物学特性

1.1.2 苏云金芽胞杆菌的杀虫晶体蛋白

1.2 双组分信号转导系统简介

1.2.1 双组分信号转导系统

1.2.2 组氨酸激酶

1.2.3 应答调节蛋白

1.2.4 革兰氏阳性细菌的双组分信号转导系统的研究进展

1.3 研究目的和意义

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 基因组序列来源

2.1.2 菌种与质粒

2.1.3 培养基、抗生素

2.1.4 仪器和试剂

2.1.4.1 主要仪器

2.1.4.2 主要试剂

2.1.5 常用溶液与缓冲液

2.1.5.1 大肠杆菌质粒提取液

2.1.5.2 总DNA提取液

2.1.5.3 核酸电泳缓冲液

2.1.5.4 RNA试剂

2.1.5.5 SDS-PAGE电泳用

2.2 实验方法

2.2.1 HKs和RRs预测及结构与功能分析

2.2.2 DNA体外操作方法

2.2.2.1 DNA体外重组操作

2.2.2.2 苏云金芽胞杆菌染色体DNA的提取

2.2.2.3 大肠杆菌质粒的提取

2.2.2.4 PCR扩增

2.2.3 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化

2.2.4 RNA操作方法

2.2.4.1 Trizol提取RNA

2.2.4.2 测RNA质量抽提的质量

2.2.4.3 RT-PCR步骤

2.2.5 蛋白质SDA-PAGE

2.2.5.1 SDS-PAGE样品及凝胶的制备

2.2.5.2 电泳、染色及脱色

2.2.6 目的基因的克隆、表达和纯化

2.2.6.1 yycG、yycH、yycI、yycF基因的克隆

2.2.6.2 YycG、YycH、YycI基因的表达

2.2.6.3 YycG、YycH、YycI蛋白纯化

2.2.7 细菌双杂交实验

2.2.7.1 细菌双杂交中质粒和载体的构建

2.2.7.2 细菌双杂交检测蛋白-蛋白相互作用

2.2.8 Pull-down实验

2.2.9 yycF过表达实验

3 结果与分析

3.1 苏云金芽胞杆菌双组分系统的生物信息学分析

3.1.1 苏云金芽胞杆菌双组分系统的多样性

3.1.2 苏云金芽胞杆菌HKs的结构域组成及其分类

3.1.3 苏云金芽胞杆菌RRs的结构域组成及其分类

3.1.4 苏云金芽胞杆菌TCS的功能预测

3.1.5 苏云金芽胞杆菌TCS的调控网络

3.1.6 小结

3.2 yycG、yycF、yycH和yycI的基因克隆、原核表达和纯化

3.2.1 yycG、yycH和yycI原核表达载体的构建

3.2.2 YycG、YycH和YycI的表达和纯化

3.2.3 小结

3.3 YycG、YycH和YycI之间的物理作用

3.3.1 YycH、YycI与YycG的物理作用

3.3.2 小结

3.4 细菌双杂交实验分析YycG与YycH、YycI的相互作用

3.4.1 细菌双杂交重组质粒的构建

3.4.2 YycG与YycH、YycI的相互作用

3.4.3 小结

3.5 应答蛋白YycF在BMB171中的过表达研究

3.5.1 yycF过表达载体构建

3.5.2 原始BMB171菌株和过表达重组菌株的RT-PCR分析

3.5.3 原始菌株和过表达重组菌株的生物学特性比较

3.5.4 原始BMB171菌株和过表达重组菌株的比较

3.5.5 小结

4 总结与讨论

4.1 总结

4.2 讨论

4.3 下一步工作设想

参考文献

致谢

附录

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标签：苏云金芽胞杆菌论文; 双组分信号转导系统论文; 组氨酸激酶论文; 应答调节蛋白论文; 操纵子论文;

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