流体切应力对血管内皮细胞和平滑肌细胞迁移与增殖的影响及其机制

论文摘要

血管重建（remodeling）是指机体在生长、发育、衰老和疾病等过程中,血管为适应体内外环境的变化而发生的形态结构和功能的改变。力学因素在血管重建中起着重要作用。血管内皮细胞（endothelial cells,ECs）和血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells, VSMCs）是血管的主要组成细胞。ECs和VSMCs的迁移与增殖异常是心血管病血管重建的主要特征之一。然而,力学因素对血管重建的影响是一个十分复杂的调控系统,流体切应力调控血管重建的力学生物学机制仍未完全阐明。因此,研究切应力对联合培养ECs及VSMCs迁移与增殖的影响及其机制,对于深入了解心血管活动和心血管疾病发生的本质,寻求心血管疾病防治的新措施具有重要的理论和临床意义。本文首先在我们前期力学-血管蛋白质组学研究,得到低切应力条件下血管组织Rab28蛋白表达明显升高的结果基础上,进一步探讨Rab28蛋白在低切应力调控血管细胞迁移中的作用。应用ECs与VSMCs联合培养模型及平行平板流动腔系统,分别施加5 dyn/cm2低切应力和15 dyn/cm2正常切应力,加载时间为12 h,以静态ECs与VSMCs联合培养为对照组,用Western blotting检测Rab28和p-ERK表达的变化;Transwell法检测细胞迁移;RNA干扰阻断Rab28,以探讨低切应力对VSMCs迁移的影响及其机制。然后,我们进一步研究正常切应力及VSMCs单独及协同对ECs增殖的影响。对联合培养的ECs与VSMCs施加15 dyn/cm2正常切应力,加载时间为12 h,以未施加切应力的ECs与VSMCs静态联合培养、ECs与VSMCs隔开静态培养为对照组;同时对单独培养的ECs施加15dyn/cm2正常切应力,加载时间12 h,以静态单独培养ECs为对照组,用Western blotting方法检测反映细胞增殖能力的分子PCNA和信号分子p-Akt的表达变化。结果显示:①低切应力明显地诱导了联合培养VSMCs的迁移、Rab28蛋白表达和ERK磷酸化;②低切应力促进了联合培养ECs的ERK磷酸化;③静态条件下,SiRNA干扰抑制Rab28的活性表达,对ECs和VSMCs的ERK磷酸化无影响,却能够显著地下调它们的迁移能力;④ECs与VSMCs联合培养、ECs与VSMCs隔开培养均明显地诱导了ECs的PCNA蛋白表达并上调了Akt磷酸化;⑤正常切应力加载降低了VSMCs诱导的ECs的PCNA蛋白表达及Akt磷酸化;⑥TGFβ1封闭性抗体抑制了隔开培养VSMCs诱导的ECs的PCNA蛋白表达和Akt磷酸化。上述结果提示,低切应力促进体外联合培养VSMCs的迁移,VSMCs通过直接接触和旁分泌作用促进ECs增殖,其机制与转运蛋白Rab28及信号分子Akt有关。正常切应力能抑制ECs与VSMCs的迁移与增殖,以维持血管结构和功能的稳定。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论
• 1.1 低切应力与血管重建
• 1.2 切应力对血管细胞迁移和增殖的调节
• 1.3 本课题的研究思路及主要内容
• 第2章 Rab28 蛋白在切应力调控血管内皮细胞和平滑肌细胞迁移中的作用
• 2.1 引言
• 2.2 实验仪器与材料
• 2.2.1 实验仪器
• 2.2.2 主要试剂
• 2.2.3 主要溶液成分及配制
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 细胞培养与鉴定
• 2.3.2 用于VSMCs 和ECs 联合培养的平行平板流动腔系统
• 2.3.3 细胞迁移实验
• 2.3.4 SiRNA Rab28 干扰实验
• 2.3.5 蛋白提取
• 2.3.6 蛋白免疫印迹检测（Western blotting）
• 2.3.7 RNA 的提取（TRIzol 法）
• 2.3.8 RT-PCR 实验
• 2.3.9 统计学方法
• 2.4 实验结果
• 2.4.1 原代培养的ECs 和VSMCs 形态观察及鉴定
• 2.4.2 低切应力对联合培养细胞Rab28 蛋白表达及ERK 磷酸化水平的影响
• 2.4.3 低切应力诱导细胞迁移
• 2.4.4 SiRNA 有效片段筛选
• 2.4.5 SiRNA 干扰Rab28 后抑制了血管细胞的迁移
• 2.4.6 SiRNA 干扰Rab28 对细胞的ERK 磷酸化无显著影响
• 2.5 讨论
• 2.5.1 切应力对与ECs 联合培养VSMCs 迁移的影响
• 2.5.2 切应力对血管细胞Rab28 表达的影响
• 2.5.3 Rab28 参与切应力调控VSMCs 迁移的机制
• 2.6 小结
• 第3章 切应力及血管平滑肌细胞对内皮细胞增殖的影响
• 3.1 引言
• 3.2 实验仪器与材料
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 细胞培养
• 3.3.2 蛋白提取
• 3.3.3 封闭性抗体实验
• 3.3.4 实验分组
• 3.3.5 统计学方法
• 3.4 实验结果
• 3.4.1 正常切应力抑制ECs 增殖
• 3.4.2 切应力与VSMCs 联合作用对ECs 增殖的影响
• 3.4.3 细胞直接接触及旁分泌在VSMCs 诱导ECs 增殖中的作用
• 3.4.4 TGFβ1 在VSMCs 诱导ECs 增殖中的作用
• 3.5 讨论
• 3.5.1 PCNA 和Akt 与细胞增殖的关系
• 3.5.2 切应力与VSMCs 单独及协同对ECs 增殖的调节
• 3.6 小结
• 全文小结
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间已完成或发表的学术论文