天府肉鹅IFN-α基因克隆表达及抗病毒活性的研究

论文摘要

此文对天府肉鹅IFN-a （TFGoIFN-a）基因（GenBank登录号HQ115583）开展了以下系列研究：TFGoIFN-a基因克隆、TFGoIFN-a原核表达、重组蛋白复性、复性蛋白抗病毒活性的研究。1.TFGoIFN-a基因克隆及生物信息学分析CoA诱导培养天府肉鹅外周血单核细胞,提取RNA,经过RT-PCR扩增得到天府肉鹅IFN-a基因片段,大小为648bp,构建pMD19-TFGoIFN-a克隆载体并测序。TFGoIFN-a基因含有一个576bp的ORF,191个氨基酸组成,分子量大小大约为21kDa,并且信号肽为前28个氨基酸组成,信号肽与成熟肽的切割位点在第28与29个氨基酸之间。TFGoIFN-a是一个多G或C结尾密码子的基因,C3s（密码子第三位为C）的密码子占81.29%,偏爱程度很高。密码子偏爱性特征分析鹅IFN-a基因与鸭IFN-a基因偏爱特征相似,与鸡IFN-a基因有所不同。TFGoIFN-a基因密码子偏爱程度与E.coli,酵母以及人类总密码子偏爱程度的比值比较,差值较大的E. Coli系统有47个,Yeast系统有46个,Human系统有45个。2.TFGoIFN-a表达载体的表达根据信号肽位置设计一对引物,扩增成熟肽TFGoIFN-a片段,构建PMD19-mTFGoIFN-a,并送公司测序,将测序正确的pMD19-mTFGoIFN-a载体与pET-32a（+）双酶切构建表达载体pET-32-mTFGoIFN-α,转化大肠杆菌Rosetta （DE3）,采用IPTG诱导表达得到大小为38kDa的重组蛋白,主要以包涵体的形式存在,表达量较大,大约为6mg/mL。3.重组表达蛋白TFGoIFN-a复性及其抗病毒活性的检测TFGoIFN-a重组蛋白通过稀释透析以及Ni-IMAC亲和层析复性后,检测到抗VSV活性为104U/mL,比活性为5.5X103U/mg。并且在GEF和DEF中检测到天府肉鹅IFN-a重组蛋白抗VSV效果是一致的。复性后的鹅IFN-a重组蛋白进行抗GPV, IFN保护组以及GPV组病毒拷贝数之间存在显著性差异（P<0.05）,鹅IFN重组蛋白具有抗GPV的活性作用。在GEF中检测得到,对GPV病毒的相对抑制率高达89.4%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 干扰素研究概况
• 1 干扰素的分类及特征分析
• 2 IFN生物学活性及其机制的研究进展
• 2.1 IFN生物学活性的研究进展
• 2.2 IFN受体研究概况
• 2.3 IFN抗病毒活性机制的研究概况
• 2.3.1 PKR研究概况
• 2.3.2 OAS和RNase L研究概况
• 2.3.3 ADAR和Mx蛋白研究概况
• 3 IFN在临床中的应用
• 4 禽类干扰素的研究概况
• 5. 选题目的意义
• 第二章 天府肉鹅IFN-α基因克隆表达及抗病毒活性的研究
• 1 材料
• 1.1 菌株及表达载体
• 1.2 毒株及细胞
• 1.3 实验动物
• 1.4 主要试剂及配制
• 1.4.1 LB液体培养基
• 1.4.2 SDS-PAGE电泳相关液体
• 1.4.3 Western-blot相关试剂
• 1.4.4 细胞培养的相关溶液配制
• 1.4.5 透析复性相关试剂
• 1.4.6 Ni-IMAC复性相关试剂
• 1.5 主要实验仪器设备
• 2 实验方法
• 2.1 RT-PCR扩增天府肉鹅IFN-α基因
• 2.1.1 引物设计
• 2.1.2 天府肉鹅淋巴细胞培养以及总RNA的提取
• 2.1.3 RT-PCR扩增天府肉鹅IFN-α基因
• 2.2 天府肉鹅IFN-α基因的T-载体克隆与鉴定
• 2.2.1 天府肉鹅IFN-α基因的T-载体克隆
• 2.2.2 感受态细胞的制备及转化
• 2.2.3 转化菌落的鉴定和筛选
• 2.3 天府肉鹅IFN-α基因的生物信息学分析
• 2.3.1 数据
• 2.3.2 分析方法
• 2.4 表达载体的构建
• 2.4.1 引物设计
• 2.4.2 天府肉鹅干扰素-α成熟肽基因的PCR扩增
• 2.4.3 扩增产物的回收与纯化
• 2.4.4 PCR纯化产物与克隆载体的连接
• 2.4.5 连接产物的转化
• 2.4.6 重组原核表达质粒的构建
• 2.4.7 连接产物的转化
• 2.4.8 转化菌落的筛选和鉴定
• 2.5 重组蛋白的诱导表达及条件优化
• 2.5.1 重组质粒pET-32-mTFGoIFN-α转化表达菌
• 2.5.2 原核表达质粒pET-32-mTFGoIFN-α的诱导表达
• 2.5.3 重组质粒表达条件的优化
• 2.5.4 蛋白的纯化及鉴定
• 2.6 兔高免血清的制备
• 2.6.1 重组蛋白抗原的制备
• 2.6.2 免疫程序
• 2.6.3 琼脂扩散试验检测兔抗TFGoIFN-α抗体效价
• 2.6.4 Western-blot检测抗体特异性
• 2.7 重组鹅IFN-α蛋白复性
• 2.7.1 透析复性
• 2.7.2 Ni-IMAC纯化复性
• 2.7.3 蛋白浓度的测定
• 2.8 鹅IFN-α重组蛋白抗VSV活性的研究
• 2.8.1 鹅胚成纤维细胞培养
• 2.8.2 鸭胚成纤维细胞培养
• 2.8.3 VSV效价TCID50的测定
• 2.8.4 鹅IFN-α重组蛋白抗VSV活性
• 2.9 定量PCR法检测鹅IFN-α重组蛋白抗小鹅瘟病毒活性
• 3 结果
• 3.1 天府肉鹅IFN-α基因的扩增
• 3.1.1 TFGoIFN-α基因的扩增
• 3.1.2 TFGoIFN-α基因的T-克隆与鉴定
• 3.2 TFGoIFN-α基因生物信息学分析
• 3.2.1 TFGoIFN-α基因分析
• 3.2.2 TFGoIFN-α基因密码子特征分析
• 3.3 重组表达质粒pET-32-mTFGoIFN-α的构建
• 3.4 重组蛋白的表达及条件优化
• 3.4.1 重组蛋白的表达
• 3.4.2 IPTG浓度的优化
• 3.4.3 诱导时间的优化
• 3.5 兔抗天府肉鹅IFN-α重组表达蛋白多克隆抗体的检测
• 3.5.1 兔抗鹅IFN-α血清琼脂扩散试验的检测
• 3.5.2 兔抗血清的Western Blotting检测
• 3.6 TFGoIFN-α重组表达蛋白复性
• 3.6.1 TFGoIFN-α重组表达蛋白复性效果检测
• 3.6.2 TFGoIFN-α重组表达蛋白复性后浓度测定
• 3.7 TFGoIFN-α重组表达蛋白抗VSV活性
• 3.8 SYBR Green real-time PCR测鹅IFN-α抗GPV活性
• 4 讨论
• 4.1 基因克隆引物和表达引物的设计
• 4.2 TFGoIFN-α基因特征分析
• 4.3 诱导表达
• 4.4 蛋白的复性
• 4.5 鹅IFN-α重组蛋白抗病毒活性
• 第三章 结论
• 第四章 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 攻读学位期间发表的学术论文