口蹄疫病毒VP1基因的序列分析及巢式PCR检测研究

论文摘要

将疑似口蹄疫病料送检到中国农业科学院兰州兽医研究所国家口蹄疫参考实验室进行口蹄疫病毒的鉴定,鉴定该病料为O型口蹄疫病毒感染病料。 根据Genbank中注册的O型口蹄疫病毒株VP1基因序列,设计出了一对引物,应用RT-PCR方法对疑似口蹄疫病料进行VP1基因的检测,并对VP1基因进行测序。结果表明,此口蹄疫病毒株的VP1基因的全长639bp,编码213个氨基酸,国内外发表的O型毒株VP1基因核苷酸序列相比较的同源性在75.7-93.3%之间。VP1基因所推导氨基酸序列（1D蛋白）同源率在85.0～92.5%之间。该病料株与台湾和南通流行的O型口蹄疫病毒株亲缘性最近。对VP1基因的序列测定和分析,丰富了我国FMDV毒株VP1基因资料库。 本研究在应用RT-PCR对VP1基因的扩增和测序的基础上。选择VP1基因内相对保守的区域设计一对引物,建立检测FMDV VP1基因的巢式PCR方法。通过对RT-PCR产物的二次扩增,能特异性的检测出500bp左右的目的片段。本试验所建立的巢式PCR方法特异性好,不与猪水泡病病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒、猪细小病毒出现交叉反应。通过部标RT-PCR方法和nested PCR方法的敏感性比较研究,部标RT-PCR方法能检测出样品中病毒核酸量大于或等于0.23ng/μl的被检材料;nested RT-PCR能检测出样品中病毒核酸量大于或等于0.23×10-2ng/μl的被检材料。本试验所建立的nested PCR较敏感。在部标RT-PCR、常规RT-PCR和nested PCR方法的基础上,本试验提出了nested PCR方法检测口蹄疫病毒的操作规程。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1、前言
• 1.1 口蹄疫的研究概况
• 1.2 口蹄疫病毒分子生物学国内外研究进展
• 1.3 口蹄疫病毒检测方法的国内外研究进展
• 1.4 存在问题
• 1.5 本研究的目的和意义
• 2、技术路线
• 3、材料及仪器
• 3.1 毒株与病料
• 3.2 试剂盒、试剂
• 3.3 主要仪器
• 4、试验方法
• 4.1 样品的收集与处理
• 4.2 反向间接血凝试验
• 4.3 病毒的鉴定
• 4.4 病毒RNA／DNA的抽提
• 4.5 VP1基因的RT-PCR检测
• 4.6 VP1基因的测序
• 4.7 巢式PCR方法的研究
• 5、结果
• 5.1 反向间接血凝试验结果
• 5.2 病毒的鉴定
• 5.3 VP1基因的RT-PCR检测
• 5.4 VP1基因的序列测定及分析
• 5.5 巢式PCR检测方法的研究结果
• 5.6 口蹄疫病毒巢式PCR方法诊断技术规程的提出
• 6、讨论
• 6.1 目的基因的选择
• 6.2 巢式PCR检测方法
• 6.3 口蹄疫病毒检测的安全性
• 7、结论
• 参考文献
• 致谢