水牛卵母细胞体外成熟及其调控的研究

论文摘要

1.探讨了蛋白激酶C（PKC）在水牛卵母细胞成熟过程中的作用。结果发现:（1）添加PKC激活剂PMA抑制水牛卵母细胞的成熟,而添加PKC抑制剂Calphostin C促进水牛卵母细胞的成熟,且PMA对水牛卵母细胞成熟抑制作用不能被FSH解除。（2）PKC抑制剂Calphostin C能解除磷酸二酯酶抑制剂milrinone对水牛卵母细胞成熟的抑制作用。（3）第一次减数分裂的中晚期PKC活性的降低可能是卵母细胞退出MⅠ期进入后期和MⅡ期所必需的。2.探讨了水牛卵母细胞成熟过程中PKC基因的表达动态变化及其与卵母细胞成熟的关系。收集不同成熟培养时间（0,4,8,12,16,20和24h）的水牛卵母细胞,运用实时荧光定量PCR的方法检测PKC基因的表达动态变化,同时检查卵母细胞成熟培养在这7个时间点（0,4,8,12,16,20和24h）的核成熟状态。结果发现,水牛卵母细胞成熟过程的前12h,伴随着水牛卵母细胞GVBD的发生,PKC基因的表达水平逐步提高;而后12h,随着PBI的排出,PKC基因的表达水平降低,表明PKC基因在水牛卵母细胞的成熟过程中可能具有重要作用。3.探讨了水牛卵母细胞成熟过程中PKC的激活对其随后受精和胚胎发育的影响。水牛卵丘-卵母细胞复合体在不同成熟培养液(即添加1mg/mLPVA,5%FCS,1.62×10-6mol/L PMA+1mg/mL PVA,1.62×10-6mol/L4a-PDD+1mg/mL PVA)中成熟24小时后通过SDS-PAGE电泳和Westernblot检测PKC的表达情况。结果发现,PMA处理组没有检测到分子量大约为80 kDa的PKC蛋白,而其余各组均检测到PKC蛋白的存在,表明PKC激活剂PMA长时间处理水牛卵母细胞可能会导致PKC蛋白的耗竭而消失。同时对PMA和Calphostin C成熟培养的水牛卵母细胞体外受精后的原核形成率及其分裂率进行了研究,结果发现:（1）在卵母细胞成熟过程中激活PKC有利于提高两原核的形成率,但降低受精分裂率。（2）在水牛卵母细胞成熟12小时后,在成熟液中添加较低浓度(小于10-7mol/L)PKC抑制剂Calphostin C对卵母细胞受精后的分裂率没有影响,但当浓度增大到1.26×10-6mol/L时,分裂率明显降低。4.探讨了磷酸二酯酶抑制剂米力农（milrinone）对水牛卵母细胞体外成熟的影响。结果发现:（1）Milrinone对水牛COCS的自发成熟具有抑制作用,且这种抑制作用能够稳定维持一定时间。（2）Milrinone能显著抑制FSH诱导的水牛COCS体外成熟,但是随着时间的延长,这种抑制作用可以部分被FSH克服。（3）Milrinone对水牛卵母细胞的核成熟抑制作用是可逆的,其抑制作用解除后水牛卵母细胞可正常成熟。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 前言
• 文献综述
• 第一章 哺乳动物卵母细胞成熟调控的研究进展
• 第一节 蛋白激酶C（PKC）在卵母细胞减数分裂成熟中的作用
• 1.1 PKC的分类
• 1.2 PKC的结构
• 1.3 蛋白激酶C在卵母细胞第一次减数分裂成熟过程中的调节作用
• 1.3.1 PKC可能与卵母细胞第一次减数分裂的启动调节有关
• 1.3.2 PKC可能与第一次减数分裂中/后期的转换的调节有关
• 1.4 PKC在卵子活化过程中的调节作用
• 1.4.1 PKC在卵子活化过程中的转位
• 2+的关系'>1.4.2 PKC与皮质颗粒的排放和Ca²⁺的关系
• 1.4.3 PKC激活剂所诱导的皮质颗粒排放与受精中皮质颗粒排放的关系
• 1.4.4 PKC和MAPK的关系
• 1.4.5 PKC与减数分裂完成
• 1.5 PKC信号通路研究的发展趋势
• 第二节 磷酸二酯酶（PDE）在卵母细胞成熟过程中的作用
• 2.1 PDE超家族
• 2.2 哺乳动物卵母细胞减数分裂和减数分裂能力的获得
• 2.3 卵泡内环境和卵母细胞中高浓度cAMP导致减数分裂的阻滞
• 2.4 PDE3A在调节卵母细胞减数分裂过程中起着重要的作用
• 2.5 PDE与减数分裂的启动
• 实验研究
• 第二章 蛋白激酶C在水牛卵母细胞成熟过程中的作用
• 1. 材料和方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 4. 结论
• 第三章 水牛卵母细胞成熟过程中蛋白激酶C mRNA表达的研究
• 1. 材料与方法
• 2. 结果与分析
• 3. 讨论
• 4. 结论
• 第四章 水牛卵母细胞成熟过程中PKC的激活对其受精和早期胚胎发育的影响
• 1. 材料和方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 4. 结论
• 第五章 磷酸二酯酶抑制剂对水牛卵母细胞体外成熟的影响
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 4. 结论
• 参考文献
• 英文缩写——中文对照表
• 图片与说明
• 致谢
• 攻读博士学位期间发表的学术论文