论文题目: 根癌农杆菌介导的AP1基因转化菊花的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 园林植物与观赏园艺
作者: 吕晋慧
导师: 张启翔
关键词: 菊花,基因,再生系统,遗传转化系统,花期
文献来源: 北京林业大学
发表年度: 2005
论文摘要: 菊花（Chrysanthemum morifolium Ramat.）是我国的传统名花和四大切花之一,花期相对集中,大都在秋季。春菊、夏菊品种少。花分生组织特征基因AP1的异源表达可以加快花发育进程,使菊花花期提前。利用基因工程技术导入AP1基因改变现有观赏性较高的菊花花期有重要意义,国内外尚未见相关报道。本研究是在国家科技部转基因研究与开发专项（JY03-B-28）项目支持下完成的。作者通过近4年的研究从9个品种中筛选出三个菊花品种‘紫妍’、‘黄秀芳’、‘玉人面’的高频再生体系。建立并优化了遗传转化体系,首次把花分生组织特征基因AP1转入地被菊‘玉人面’中,获得了11株转基因植株,并在此基础上筛选出两株花期提前的株系。主要研究结果如下: 1.以MS为基本培养基,采用了4种不同类型的生长调节剂组合,从中筛选出适合菊花叶片外植体再生的生长调节剂组合是6-BA和NAA,并在此基础上比较探讨了不同激素配比、不同基因型、不同生理状态的叶片、外植体类型、继代培养时间及添加剂AgNO3等因素对不定芽再生的影响。研究结果表明:菊花再生对基因型具有依赖性,9个品种中只有3个品种:‘紫妍’、‘玉人面’、‘黄秀芳’可以高频再生,再生率分别为93%、96%、95%;不同生理状态的叶片再生能力不同,15～25d苗龄的菊花无菌苗中上部充分展开的幼嫩叶片再生率最高;不同菊花品种的同种外植体再生能力不同,同品种的不同外植体再生能力也不同,其中‘紫妍’、‘黄秀芳’、‘玉人面’、‘L12M57’的叶片再生能力显著高于‘神马’叶片再生能力。‘黄秀芳’的茎段、叶片、叶柄均可高频再生,其它品种的叶片再生能力高于其它外植体的再生能力;继代培养时间影响菊花叶片外植体的形态发生能力的保持或丧失。总体规律是随着继代次数增加叶片外植体形态发生能力下降。但不同品种保持高的形态发生能力的时间不同;AgNO3对不同品种的再生率影响不同,但都未能提高再生率和不定芽数量;不适宜的培养条件和不同来源的外植体影响‘紫妍’叶片的再生能力。Vc、活性炭未能克服‘紫妍’外植体的褐化现象,而高浓度的生长素（NAA）有效抑制紫妍外植体的褐化现象,再生率提高。 2.构建了植物表达载体pBI-AP1,并通过液氮冻融法将植物表达载体pBI-AP1导入农杆菌EHA105、LBA4404中。 3.研究讨论了不同菊花品种对不同抗生素的敏感性,研究认为10mg/L的G418是菊花品种‘紫妍’、‘玉人面’叶片外植体筛选培养的临界耐受浓度。20mg/L的卡那霉素是‘黄秀芳’叶片筛选培养的临界浓度和生根筛选的临界浓度。400mg/L以上浓度抑菌素均不同程度影响叶片外植体的再生率和平均再生不定芽数,其中头孢霉素比羧卞青霉素抑制作用强。两种抑菌抗生素对菊花苗生长的影响总体规律是随抗生素浓度的递增,菊花苗生根数量递增、根长递减、苗高降低。其中头孢霉素对菊花的抑制
论文目录:
摘要
ABSTRACT
1 引言
1.1 菊花基因工程研究进展
1.1.1 菊花受体系统的研究
1.1.2 菊花遗传转化体系的建立
1.1.3 菊花基因工程中存在的问题
1.1.3.1 提高转化率
1.1.3.2 提高对转化外源基因表达的调控能力
1.1.4 展望
1.2 高等植物成花机理研究进展
1.2.1 花发育概述
1.2.1.1 花诱导
1.2.1.2 花发育的基因调控
1.2.1.3 花器官形成的基因调控
1.2.2 花发育调控基因的结构特征与作用机制
1.2.2.1 花发育调控基因的结构特征
1.2.2.2 花发育调控基因的作用机制
1.2.3 花发育调控基因在国内外的应用研究进展
1.2.4 展望
1.3 本课题研究的目的意义和主要内容
2 菊花离体再生系统的建立
2.1 材料和方法
2.1.1 材料
2.1.2 试验方法
2.2 结果与分析
2.2.1 不同灭菌时间和不同接种时间对外植体启动培养的影响
2.2.2 不同培养基对菊花增殖培养的影响
2.2.3 不同培养基对菊花生长的影响
2.2.4 不同生长调节剂对不同菊花品种叶片外植体再生的影响
2.2.4.1 不同生长调节剂组合对菊花叶片外植体再生的影响
2.2.4.2 不同浓度6-BA和NAA对不同菊花品种叶片外植体再生的影响
2.2.4.3 影响‘紫妍’叶片外植体褐化和再生率的因素
2.2.5 Vc、活性炭对‘紫妍’叶片外植体再生的影响
2.2.6 不同苗龄及叶片着生部位对不定芽再生的影响
2.2.7 AgNO_3对菊花叶片外植体再生的影响
2.2.8 不同外植体不定芽再生能力比较
2.2.9 继代培养对菊花叶片形态发生能力的影响
2.3 结论与讨论
3 植物表达载体pBI-AP1的构建
3.1 材料和方法
3.1.1 材料
3.1.2 方法
3.2 结果和分析
3.2.1 目的片段测序及酶切图分析
3.2.2 P ZEROBLUNT Ⅱ ToPo、pBI121质粒的酶切及目的片段回收
3.2.3 重组质粒的酶切鉴定
3.2.4 植物表达载体向农杆菌转化和转化子的鉴定
4 菊花遗传转化体系的建立和转基因植株的获得
4.1 材料和方法
4.1.1 材料
4.1.2根癌农杆菌菌株及载体
4.1.3培养基及添加成分
4.1.4分子生物学试剂及缓冲液试剂的配制
4.1.5主要仪器和设备
4.2 方法
4.2.1 抗生素Cef、Carb对农杆菌的抑菌试验
4.2.2 不同抗生素对菊花叶片外植体再生和试管苗生根的影响
4.2.3 叶盘法遗传转化及筛选
4.2.4 影响遗传转化体系因素的筛选和优化
4.2.5 应用微弹轰击辅助农杆菌转化
4.3 结果与分析
4.3.1 羧卞青霉素和头孢霉素对农杆菌的抑菌效果
4.3.2 不同抗生素对菊花叶片外植体再生和试管苗生根的影响
4.3.2.1 不同选择抗生素对菊花叶片外植体再生的影响
4.3.2.2 不同抗生素对菊花生根的影响
4.3.2.3 羧卞青霉素和头孢霉素对叶片再生的影响
4.3.2.4 羧卞青霉素和头孢霉素对菊花无菌苗生长的影响
4.3.3 菊花遗传转化体系的优化
4.3.3.1 预培养时间的确定
4.3.3.2 农杆菌浓度、侵染时间的确定
4.3.3.3 共培养温度和时间的确定
4.3.3.4 选择压对转化率的影响
4.3.4 转基因植株的获得
4.3.5 微弹轰击辅助农杆菌转化
4.4 讨论与结论
5 转AP1基因植株的检测
5.1 材料和方法
5.1.1 材料
5.1.2 方法
5.2 结果与分析
5.2.1 转基因植株的GUS检测
5.2.2 转AP1基因植株的PCR检测
5.2.3 探针标记效率的检测
5.2.4 转基因植株的PCR-Southern检测
5.2.5 转基因植株的Southern-blotting杂交分析
5.2.6 转基因菊花苗叶片再生能力鉴定
5.2.7 转AP1基因抗性株的性状分析
5.2.7.1 转基因菊花的营养生长
5.2.7.2 转基因菊花开花特性
5.3 结论与讨论
6 结论
参考文献
附录
个人简历
导师简介
致谢
发布时间: 2007-01-10
参考文献
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