MPTP致慢性帕金森病小鼠模型的蛋白质组学研究

论文摘要

目的①利用双向凝胶电泳（2-DE）技术对神经毒素1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl- 1,2,3,6 -tetrahydropyridine, MPTP）小剂量长期注射诱导的帕金森病（Parkinson’s disease, PD）小鼠模型与生理盐水等量长期注射（对照组）小鼠特定区域的蛋白质表达谱进行比较,筛选出可能的PD分子生物标志物。②对2-DE图谱上的部分差异蛋白点进行酶解,利用MAILD-TOF -MS对差异蛋白点进行分析、数据搜索,确定PD的疾病特异性蛋白（disease-specific proteins,DSPs）。方法①构建MPTP小剂量长期注射诱导的慢性帕金森病（Parkinson’s disease, PD）小鼠模型和对照组。构建MPTP诱导的慢性帕金森病小鼠模型实验组时,给予MPTP背部皮下注射;对照组给予等量生理盐水背部皮下注射。连续注射完毕后,于不同时间点,观察各组小鼠是否出现类帕金森病样症状,并采用行为学方法判定模型成功与否。②取实验组和对照组小鼠黑质和纹状体区组织提取蛋白。③分别运用未处理和TCA/丙酮沉淀法再提蛋白质组,行双向电泳。④以固相pH梯度等电聚焦（IPG-IEF）为第一向,垂直平板十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）为第二向进行2-DE。⑤银染法对电泳后的凝胶进行染色。⑥采集凝胶图像并进行图像分析,寻找有意义的差异蛋白点。⑦对部分差异蛋白质点进行酶解,质谱（mass spectrometry,MS）鉴定。结果①行为学观察结果:与对照组比较,实验组小鼠爬杆时间延长有明显差异（p<0.05）,且出现震颤、竖毛、前腿抬高、竖尾、动作缓慢和减少等异常行为,对照组未出现帕金森病样异常行为。②MPTP慢性PD小鼠和对照组小鼠黑质2-DE图谱（pH3-10和pH4-7）和纹状体2-DE图谱（pH3-10）的比较,发现利用pH4-7的IPG胶条对黑质蛋白质进行2-DE分析时分辨率优于利用pH3-10 IPG胶条的2-DE凝胶;③通过获得的2-DE图谱对蛋白质的2种提取方法进行比较,发现对初步提取出的蛋白质无需进一步处理亦可得到满意的图谱,应用TCA/丙酮沉淀法再提蛋白质在量和质上都有较大损失;④利用PDQUEST 8.0图像分析软件对2-DE凝胶蛋白点进行分析,pH4-7范围的2-DE图谱上,MPTP慢性PD小鼠模型黑质中检测到（812±21）个蛋白点,对照组为（775±38）个,比较两组2-DE图谱显示:MPTP慢性PD小鼠黑质中有18个蛋白点含量低表达,另有13个蛋白点含量高表达,还有2个新出现的蛋白点;pH3-10范围的2-DE图谱上,纹状体检测到（912±21）个蛋白点,对照组为（875±38）个,比较两组2-DE图谱显示:MPTP慢性PD小鼠纹状体中有6个蛋白点含量低表达,另有4个蛋白点含量高表达,还有2个新出现的蛋白点;⑤利用质谱技术对其中部分蛋白点进行鉴定,处理组黑质中高表达的蛋白质为α-烯化酶（α-enolase ）,新出现的蛋白质为:肿瘤坏死因子受体4（Tumor necrosis factor ligand superfamily member4）、周期素依赖性蛋白激酶抑制因子1B（Cyclin-dependent kinase inhibitor 1B,Cyclin-dependent kinase inhibitor p27）;纹状体低表达的蛋白质为线粒体分裂调节蛋白1 （Mitochondrial fission regulator 1）、泛素样蛋白3前体（Ubiquitin-like protein 3 precursor）,新出现的蛋白质为S100蛋白A10（Protein S100-A10）,高表达的为Lin-7 homolog B。结论用MPTP小剂量长期注射诱导的慢性帕金森病（Parkinson’s disease, PD）小鼠模型是一种较为理想的能代表帕金森病自然病程的动物模型。利用pH4-7的IPG胶条以IPG-IEF为第一向,SDS-PAGE为第二向对小鼠黑质蛋白质进行2-DE能够获得较为理想的2-DE图谱;MPTP慢性PD小鼠与对照组黑质、纹状体的蛋白质表达有明显差异,部分蛋白质在PD小鼠中高表达或低表达;对部分差异蛋白进行质谱鉴定并了解它们的功能,为以后进一步研究他们在PD早期诊断、发病机制和病程进展中的作用奠定了基础。

论文目录

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• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 文献综述
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表论文