p55PIK的转录调控机制研究

论文摘要

目的：利用荧光素酶报告基因系统,确定人p55PIK基因启动子全长序列和启动子核心序列；利用生物信息学技术,分析并预测人p55PIK基因启动子核心序列中可能影响转录活性的顺式作用元件；利用定点突变技术,观察上述DNA位点对p55PIK的转录活性的影响,明确哪些位点及相应转录因子在p55PIK的转录调节中起重要作用。方法：以从正常人基因组DNA作为模板,用聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）法扩增基因组DNA人p55PIK基因5’端非编码区DNA不同长度片段,分别克隆到pGL3-Basic荧光素酶报告基因载体得到（-651/+45）-p55PIK、（-839/+45）-p55PIK、（-1064/+45）-p55PIK、（-1243/+45）-p55PIK和（-1633/+45）-p55PIK；在HepG2、Hela细胞中,利用荧光素酶报告基因法检测各片段DNA序列的报告基因活性,确定人p55PIK基因启动子活性最强的全长序列和活性变化最大的启动子核心序列；利用生物信息学方法,分析这一启动子核心序列并预测可能与之结合的转录因子和相应的顺式作用元件；利用定点突变技术结合荧光素酶报告基因检测技术,明确哪些位点及相应转录因子对p55PIK转录活性其重要作用。结果：构建得到p55PIK基因上游调控区不同长度片段的荧光素酶报告基因载体（-651/+45）-p55PIK、（-839/+45）-p55PIK、（-1064/+45）-p55PIK、（-1243/+45）-p55PIK和（-1633/+45）-p55PIK,酶切及测序鉴定分子量及序列正确；观察各质粒的相对荧光素酶活性,HepG2中（-1243/+45）-p55PIK的相对荧光素酶活性分别为4.90±0.21,p<0.01,Hela中（-1243/+45）-p55PIK的相对荧光素酶活性分别为29.68±0.54,p<0.01；（-839/+45）-p55PIK与pGL3-p55PIK（-1243/+45）之间的相对荧光素酶差异最显著,在两种细胞系内p<0.01；对报告基因活性变化最大的（-1243/-840）片段进行预测,若干DNA位点可能分别与MZF、YY1、RUNX1、ADR1、IRF1、Delta E、p300等转录因子结合；以人p55PIK基因的启动子全长报告基因载体（-1243/+45）-p55PIK为模板,成功将上述位点分别定点突变,并比较突变前后报告基因载体荧光素酶活性的变化,结果显示,报告基因质粒突变体MZF1-mut1 （-900/-896, TGGGGA to CTAGTG）的相对荧光素酶活性显著下降（P<0.01）,余突变体荧光素酶活性变化不显著（P>0.05）结论：人p55PIK基因的启动子全长片段位于（-1243/+45）,其核心片段位于（-1243/-840）；其中若干DNA位点可能与MZF1、YY1、RUNX1、ADR1、IRF1、Delta E、p300等转录因子结合并调节p55PIK基因的转录；位于p55PIK基因的启动子（-900/-896）的" TGGGGA "位点可能与MZFl蛋白结合显著影响p55PIK基因启动子的转录水平。目的：阐明MZF1在p55PIK转录调控中的作用及其机制,并观察该作用对肿瘤细胞增殖的影响。方法：我们利用染色质免疫共沉淀法验证了MZF1蛋白与p55PIK启动子（-900/-896）位点的TGGGGA序列DNA之间的结合,阐明MZF1对p55PIK的转录调控作用的具体机制。我们分别在肿瘤细胞系中高表达、低表达了MZF1蛋白。用荧光素酶报告基因系统、荧光定量PCR法和Western Blot免疫印迹法分别检测了p55PIK基因的转录水平、mRNA水平和蛋白表达水平的变化,阐明p55PIK是否受MZF1的转录调控；利用BrdU掺入法检测了细胞DNA合成能力,利用Ki67法检测了细胞增殖相关抗原的表达,p55PIK接受MZF1蛋白的转录调控对肿瘤细胞增殖的影响。在该作用的临床意义方面,我们利用荧光定量PCR法,检测了10例结直肠癌患者的肿瘤标本和正常组织标本中的MZF1和p55PIK的mRNA水平,分析了二者的表达的变化及相关性,阐明p55PIK表达与MZF1的表达的相关性,以及p55PIK在结直肠肿瘤发生发展中的作用及意义。结果：MZF1 Antibody组和Input组均有明显的条带,而阴性对照IgG组则无明显条带。GFP-MZF1质粒组的p55PIK全长相对荧光素酶活性显著高于GFP空质粒组（P<0.01）, MZF1-SiRNA组的p55PIK全长相对荧光素酶活性较SiRNA组显著降低（P<0.01）; GFP-MZF1质粒组p55PIK的mRNA水平显著高于GFP空质粒组（P<0.01）, MZF1-SiRNA组的p55PIK的mRNA水平显著低于（SW480中P<0.01,LOVO中P<0.05）; GFP-MZF1质粒组的p55PIK蛋白表达水平显著高于GFP空质粒组（P<0.05）。GFP-MZF1质粒组DNA合成能力显著高于GFP空质粒组（P<0.01）,MZF1-SiRNA组组DNA合成能力显著低于SiRNA组（SW480中P<0.01, LOVO中P<0.05）; GFP-MZF1质粒组Ki67荧光强度显著高于GFP空质粒组（P<0.01）,MZF1-SiRNA组Ki67荧光强度显著低于SiRNA组（P<0.01）。我们对10例临床结直肠癌患者的肿瘤组织和正常组织中的MZF1和p55PIK的表达进行了检测和分析,结果显示,肿瘤组织中MZF1和p55PIK的表达显著高于正常组织（P<0.05）,且二者表达的相关系数r=0.945.结论:p55PIK基因的表达在转录水平.mRNA水平和蛋白水平受转录因子MZF1的激活。MZF1蛋白通过直接结合于p55PIK基因启动子位于（-900/-896）的TGGGGA序列进而激活p55PIK基因的转录。在临床结直肠癌标本中,p55PIK和MZF1的表达显著高于正常组织,并且二者的表达呈显著正相关。

论文目录

• 引言
• 参考文献
• 第一部分 人p55PIK基因启动子结构分析
• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 材料与方法
• 实验结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 p55PIK受MZF1转录调控的影响及其机制研究
• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 材料和方法
• 实验方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 实验方法
• 综述
• 参考文献
• 缩略词表
• 致谢