基因治疗药物中基因传递载体的应用基础研究

论文摘要

根据自主知识产权的专利工艺路线,合成具有分支结构、分子量30kD的阳离子聚合物,以此为基础构建sofast基因载体,用于大分子核酸的体外和体内的基因传递。通过sofast/DNA复合物形成、粒径、zeta电位、抗核酸酶能力、酸碱缓冲能力、结合核酸能力,以及基因融合肽dilNF-7和工作介质盐浓度的影响等分析,对sofast基因载体的转染机制做了初步的探讨。在体外试验中,采用sofast基因载体将质粒pEGFPN1、pCMV-lac Z和pGL3分别转染到HEK297细胞,通过所表达的绿色荧光蛋白、β-半乳糖苷酶和荧光素酶的检测,证实其具有高转染效率:通过HUV-EC等众多细胞株的转染,结果表明其广泛适用于众多原代培养细胞和转化细胞株的转染:采用MTT法进行其在最高效转染时的细胞毒性研究,结果表明细胞存活率高于90%,证实其细胞毒性极低;通过sofast基因载体抗血清特性研究,表明其具有抗血清特性,可以直接加到细胞培养基中,转染前后无需更换培养基,简化转染程序;通过sofast基因载体稳定性试验,结果表明sofast基因载体性质极其稳定,适合常温运送,4℃较长时间（3年以上）储存。在体内试验研究中,急性毒性试验、亚急性毒性试验、慢性毒性试验、半致死量测定、过敏试验以及热源检测等均表明sofast基因载体体内应用毒性极低,生物兼容性好;通过豚鼠尾静脉注射sofast/pEGFPN1复合物在体内表达试验,结果表明sofast基因载体体内应用仍然具有较高的转染效率,略优于目前市场占有率最高的阳离子脂质体Lipofectamine 2000。因此,所构建的sofast基因载体是一种高转染效率、低细胞毒性、稳定性好,且适用细胞类型较广泛的基因载体,适合体内外基因转染应用,是新一代阳离子聚合物基因载体的代表。而其简单,快捷的试验步骤,同样具有很好的优越性。在成功构建sofast阳离子聚合物用于大分子核酸基因传递基础上,自主合成一带巴西烯酸侧链、分子量50kD的脂质-阳离子聚合物（lipid-cationic polymer）,构建lipid-cationic polymer siRNA基因传递载体,专用于体内外小分子siRNA基因传递。通过lipid-cationic polymer/siRNA复合物形成、粒径、zeta电位、抗核酸酶能力、酸碱缓冲能力、结合核酸能力,以及基因融合肽diINF-7和质子泵抑制剂的影响等分析,对lipid-cationic polymer基因载体的转染机制做了初步的探讨。结果表明lipid-cationic polymer以阳离子聚合物为基本骨架,在阳离子聚合物侧链交联上巴西烯酸,同时具备阳离子聚合物和阳离子脂质体的某些特性,发挥运载siRNA功能。采用lipid-cationic polymer基因载体将针对GFP的siRNA转染到HT1080-EGFP和HeLa-EGFP细胞,结果绿色荧光蛋白抑制率分别为73%和72%,高于lipofectamine2000的抑制率:进一步的特异性、细胞毒性、生物毒性、生物兼容性、可降解性、理化性质稳定性等诸多特性的研究,表明所构建的脂质-阳离子聚合物介导的RNAi基因沉默技术是安全、特异和稳定的。采用靶向环氧化酶-2（COX-2）基因的siRNA特异诱导COX-2基因转录后沉默,mRNA水平的变化提示基因载体的有效性。进一步应用自己制备的COX-2多克隆抗体和单克隆抗体进行West-blot Test和免疫组化分析,从蛋白表达水平证实了基因载体介导的基因沉默是有效的。因此,lipid-cationicpolymer基因载体可作为胚胎发育、病毒感染（如SARS、肝炎）、肿瘤发生、药物筛选、基因功能及基因治疗研究的技术平台,并可望拓宽基因治疗药物中基因传递载体这一长期困扰基因治疗技术成熟的瓶颈。此外,我们还对肿瘤患者的调节型免疫复合物的免疫调节作用进行了研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1 基因治疗
• 1.1 基因治疗机理
• 1.2 基因治疗途径及步骤
• 1.3 基因治疗的原则
• 1.4 基因治疗中有待解决的关键问题
• 2 基因载体
• 2.1 病毒载体
• 2.2 非病毒载体
• 3 阳离子聚合物基因载体
• 3.1 阳离子聚合物主要类型
• 3.2 阳离子聚合物的基因传递机制
• 3.3 阳离子聚合物载体的毒性
• 4 RNAi技术
• 4.1 RNAi的发现
• 4.2 RNAi机制
• 4.3 RNAi技术的优越性
• 4.4 RNAi在基因治疗领域的应用
• 5 抗体制备技术
• 5.1 抗体的发展
• 5.2 单克隆抗体在医学中的应用
• 5.3 单克隆抗体与多克隆抗体的比较
• 6 本论文的研究内容
• 第二章 环氧合酶COX-2抗体制备
• 一、材料
• 1 常用试剂和耗材
• 2 主要设备
• 3 生物材料
• 二、试验方法
• 1 环氧合酶COX-2多克隆抗体制备
• 1.1 兔抗血清的制备
• 1.2 DOT-ELISA测效价试验
• 1.3 抗体特异性的鉴定
• 1.4 多克隆抗体的纯化
• 1.5 辣根过氧化物酶（HRP）标记多克隆抗体（过碘酸钠法）
• 2 环氧合酶COX-2单克隆抗体制备
• 2.1 免疫方案
• 2.2 免疫脾淋巴细胞制备
• 2.3 髓瘤细胞的准备
• 2.4 饲养细胞（Feeder cells）的制备
• 2.5 细胞融合
• 2.6 HAT选择杂交瘤
• 2.7 ELISA方法筛选杂交瘤细胞分泌抗体
• 2.8 杂交瘤的克隆化（有限稀释法）
• 2.9 杂交瘤细胞的冻存
• 2.10 杂交瘤细胞复苏
• 2.11 单克隆抗体的大量生产
• 2.12 单抗的纯化
• 2.13 单克隆抗体的鉴定
• 三、结果
• 1 环氧合酶COX-2多克隆抗体制备
• 1.1 多克隆抗体的效价鉴定
• 1.2 抗体的特异性鉴定
• 2 环氧合酶COX-2单克隆抗体制备
• 2.1 抗体特异性的鉴定
• 2.2 McAb的Ig类的鉴定
• 2.3 McAb效价的确定
• 2.4 单抗纯度的鉴定
• 四、讨论
• 1 COX多克隆抗体制备
• 2 COX单克隆抗体制备
• 第三章 阳离子聚合物基因传递载体的应用基础研究
• 一、材料
• 1 常用试剂
• 2 主要设备
• 3 生物材料
• 二、试验方法
• 1 阳离子聚合物基因传递载体构建
• 1.1 阳离子聚合物合成
• 1.2 基因载体工作液的制备
• 1.3 制备阳离子聚合物基因传递载体
• 2 sofast基因载体体外试验研究
• 2.1 sofast/DNA复合物形成、粒径及zeta电位分析
• 2.2 sofast/DNA复合物抗核酸酶能力
• 2.3 sofast基因载体缓冲能力
• 2.4 sofast基因载体结合核酸能力（DNA延滞试验）
• 2.5 sofast基因载体所介导的基因转染效果研究（体外应用）
• 2.6 sofast基因载体细胞毒性分析
• 2.7 sofast基因载体的抗血清特性
• 2.8 不同细胞株类型的转染操作及优化
• 2.9 转染分析时间
• 2.10 基因融合肽对sofast基因载体转染的促进作用
• 2.11 sofast基因载体稳定性试验
• 2.12 基因载体工作液盐浓度对转染效率的影响（体外）
• 3 sofast基因载体体内试验
• 3.1 sofast基因载体体内毒性试验
• 3.2 绿色荧光蛋白基因在大鼠肺肝肾细胞中的表达（体内应用）
• 3.3 体内使用时候sofast基因载体与DNA比例的优化
• 3.4 基因载体工作液盐浓度对转染效率的影响（体内）
• 4 sofast基因载体转染siRNA效果研究
• 三、结果
• 1 sofast阳离子聚合物基因传递载体构建
• 2 sofast基因载体体外试验研究
• 2.1 sofast/DNA复合物形成、粒径及zeta电位分析
• 2.2 sofast/DNA复合物抗核酸酶能力
• 2.3 sofast基因载体的缓冲能力
• 2.4 sofast基因载体结合核酸能力的研究（DNA延滞试验）
• 2.5 sofast基因载体所介导的基因转染效果研究（体外试验）
• 2.6 sofast基因载体细胞毒性分析
• 2.7 sofast基因载体的抗血清特性分析
• 2.8 不同细胞株类型的转染操作及优化
• 2.9 转染分析的时间
• 2.10 diINF-7对sofast基因载体转染效果的影响
• 2.11 sofast基因载体稳定性试验
• 2.12 基因载体工作液盐浓度对转染效率的影响（体外应用）
• 3 sofast基因载体体内试验
• 3.1 sofast基因载体体内毒性试验
• 3.2 绿色荧光蛋白基因在大鼠肝肾细胞中的表达（体内）
• 3.3 体内使用时候sofast基因载体与DNA比例的优化
• 3.4 基因载体工作液盐浓度对转染效率的影响（体内应用）
• 4 sofast基因载体转染siRNA的效果研究
• 四、讨论
• 1 sofast基因载体介导的转染机制
• 2 sofast/DNA物理特性
• 3 sofast基因载体抗核酸酶作用
• 4 sofast基因载体转染效果
• 5 sofast基因载体毒性
• 6 sofast抗血清特性
• 7 影响转染效率的因素、优化
• 8 转染分析时间
• 9 diINF-7对sofast基因载体转染效果的促进作用
• 10 sofast基因载体体内毒性试验
• 11 sofast基因载体体内应用
• 12 sofast介导的siRNA转染
• 五、小结
• 第四章 脂质—阳离子聚合物siRNA基因载体的应用基础研究
• 一、材料
• 1 常用试剂
• 2 主要设备
• 3 生物材料
• 二、试验方法
• 1 脂质—阳离子聚合物siRNA基因载体构建
• 1.1 脂质—阳离子聚合物合成
• 1.2 基因载体工作液的制备
• 1.3 制备脂质—阳离子聚合物基因传递载体
• 2 lipid-cationic polymer基因载体体外试验
• 2.1 lipid-cationic polymer/siRNA复合物形成、粒径及zeta电位分析
• 2.2 lipid-cationic polymer基因载体结合核酸能力的研究（DNA延滞试验）
• 2.3 lipid-cationic polymer基因载体缓冲能力
• 2.4 lipid-cationic polymer基因载体所介导的基因转染效果研究（体外应用）
• 2.5 lipid-cationic polymer/siRNA复合物抗核酸酶能力
• 2.6 lipid-cationic polymer基因载体细胞毒性分析验证
• 2.7 siRNA作用特异性的研究
• 2.8 降解试验
• 2.9 稳定性试验
• 2.10 lipid-cationic polymer基因载体的抗血清特性
• 2.11 基因融合肽diINF-7对lipid-cationic polymer转染效果的影响
• 2.12 质子泵抑制剂对lipid-cationic polymer转染效果的影响
• 3 lipid-cationic polymer基因载体体内试验
• 3.1 lipid-cationic polymer基因载体体内毒性试验
• 3.2 lipid-cationic polymer基因载体体内转染效果
• 三、结果
• 1 脂质—阳离子聚合物siRNA基因传递载体构建
• 2 lipid-cationic polymer基因载体体外试验
• 2.1 lipid-cationic polymer/DNA复合物形成、粒径及zeta电位分析
• 2.2 lipid-cationic polymer基因载体结合核酸能力的研究（DNA延滞试验）
• 2.3 lipid-cationic polymer基因载体缓冲能力
• 2.4 lipid-cationic polymer基因载体所介导的基因转染效果研究（体外应用）
• 2.5 lipid-cationic polymer/siRNA复合物抗核酸酶能力
• 2.6 lipid-cationic polymer siRNA基因载体细胞毒性分析验证
• 2.7 siRNA作用特异性的研究
• 2.8 降解试验
• 2.9 稳定性试验
• 2.10 lipid-cationic polymer基因载体的抗血清特性
• 2.11 diINF-7对转染效果的影响
• 2.12 质子泵抑制剂对lipid-cationic polymer转染效果的影响
• 3 lipid-cationic polymer基因载体体内试验
• 3.1 lipid-cationic polymer基因载体体内毒性试验
• 3.2 lipid-cationic polymer基因载体体内转染效果
• 四、讨论
• 1 脂质—阳离子聚合物转染siRNA机制的探讨
• 2 pH缓冲能力、抗核酸酶作用
• 3 lipid-cationic polymer/siRNA复合物物理特性
• 4 转染特性
• 5 lipid-cationic polymer体内转染
• 五、小结
• 第五章 肿瘤患者IgM/IgG类免疫复合物的免疫调节作用
• 一、引言
• 二、材料和方法
• 1.实验材料
• 2 研究对象
• 3.主要仪器
• 二、方法
• 1 Ig/Ig-TCIC测定
• 2 血清总、游离和复合Ig的测定
• 3 统计学检验
• 三、结果
• 1 肿瘤患者总IgM和IgG水平
• 2 肿瘤患者复合IgM和IgG水平
• 3 肿瘤患者IgM/IgG-TCIC水平
• 4 肿瘤患者IgG/IgM-TCIC水平
• 四、讨论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读博士期间发表的论文
• 攻读博士期间申报的国家发明专利