论文摘要
第一部分流感病毒神经氨酸酶及其抑制剂的研究背景流行性感冒（流感）是由流感病毒引起的上呼吸道疾病,每年影响数百万人的健康,造成比较严重的经济和社会问题。目前全球范围内流行的H5N1禽流感即属于其中的一个亚型,由于人类对流感病毒普遍缺乏免疫力以及人类感染H5N1禽流感病毒后的高死亡率,世界卫生组织认为这是对人类存在潜在威胁最大的疾病之一。但是到目前为止,人类对流感病毒一直缺乏安全有效的控制手段,这使得抗流感病毒药物研究成为当前药学研究的一个热点。近年来,随着病毒学研究的进展,对流感病毒复制和感染过程的机理研究取得了重大的突破,在此基础上提出了一些可作为抗流感药物研究的靶标,比如血凝素、神经氨酸酶、基质蛋白M2以及核酸内切酶等。目前,国际上预防与治疗流感的主要措施有:（1）疫苗接种:由于流感病毒抗原变异极其频繁,使疫苗对新产生的病毒株无效;（2）金刚烷胺类抗病毒药物:通过阻断流感病毒M2离子通道蛋白起作用,但由于存在较为严重的神经毒性,而且长期用药易产生耐药病毒株,同时M2蛋白只存在于A型流感中,因此对B型流感无效,使其应用受到很大限制;（3）流感病毒受体阻滞剂和反义寡核苷酸:目前尚处于体外试验的基础研究阶段;（4）神经氨酸酶抑制剂:到目前为止FDA批准上市的神经氨酸酶抑制剂有两种:葛兰素公司的Zanamivir（GG167,商品名Relenza）和罗氏公司的Oseltamivir（GS4104,商品名Tamiflu）。而强生公司和BioCryst公司合作开发的Peramivir（RWJ2270201）已于2002年3月完成了Ⅲ期临床试验。此外,还有一些神经氨酸酶抑制剂类抗流感病毒药物正处于开发研究中。这类药物可同时抑制A,B型流感病毒,不易引起抗药性且耐受性好,神经氨酸酶抑制剂的发现是抗流感化学治疗药物研究中取得的重大突破性进展,由于神经氨酸酶抑制剂类药物独特的作用机制及疗效,已成为目前抗流感病毒研究的热点领域。神经氨酸酶即唾液酸酶,是存在于A、B型流感病毒表面的糖蛋白,在流感病毒复制和感染过程中起关键酶的作用。神经氨酸酶能催化裂解宿主细胞表面受体末端的唾液酸残基与糖蛋白、糖脂和寡聚糖之间的α-糖苷键,从而促进新形成的病毒粒子从宿主细胞表面释放,进而从感染的呼吸道黏膜向周围组织扩散;神经氨酸酶能够阻止病毒从宿主细胞释出后的凝聚:神经氨酸酶可通过裂解呼吸道黏膜中的唾液酸,阻止病毒灭活,促进病毒渗入呼吸道上皮细胞;神经氨酸酶对流感病毒的致病性也有作用,它能改变血凝素的糖基部分,从而增强一些菌株的毒力;神经氨酸酶也能直接激活潜在的转移生长因子β,这种细胞因子水平的增高能引起细胞凋亡;神经氨酸酶还能刺激炎症细胞因子的产生,从而增强流感感染的症状和呼吸道炎症反应。因此,神经氨酸酶成为抗流感病毒药物研究中很有吸引力的全新靶点。随着生命科学的飞速发展,神经氨酸酶及其与底物的共结晶结构均已被阐明,同时基于结构的药物设计和计算机辅助药物设计的发展使一类新型的抗流感病毒药物—神经氨酸酶抑制剂的研究取得了很大的成功,并引起了全球范围内设计、合成与筛选神经氨酸酶抑制剂的研究热潮。第二部分目标化合物的设计思路我们通过初步筛选本实验室已有的化合物对神经氨酸酶的抑制活性,发现N-乙酰-L-羟脯氨酸对神经氨酸酶有中等强度的抑制活性。因此我们以N-乙酰-L-羟脯氨酸为先导化合物,对其结构进行如下的优化:（1）吡咯环的N-位用叔丁氧羰基酰化或者拼接各种含疏水性侧链的氨基酸;（2）将1-位羧基保留或者转化为酯基或异羟肟酸基团;（3）4-位羟基保留或转化为构型翻转的氨基。在此基础上,我们设计并合成了一系列吡咯烷类神经氨酸酶抑制剂。在上述工作的基础上,我们通过初筛发现对氨基水杨酸也具有一定程度的神经氨酸酶抑制活性,同时基于苯甲酸类神经氨酸酶抑制剂—BANA 113与神经氨酸酶的共结晶结构,我们选择对氨基水杨酸作为先导化合物,对其结构进行如下的优化:（1）1-位的羧基保留或者转化为酯基或异羟肟酸基团;（2）2-位的羟基通过醚化引入各种疏水性侧链;（3）3-位的氢保留或引入硝基、氨基或胍基:（4）4-位的氨基进行乙酰化;（5）5-位引入硝基、氨基或胍基。我们设计并合成了另一系列水杨酸类神经氨酸酶抑制剂。第三部分目标化合物的合成第一个系列吡咯烷衍生物以4-羟基-L-脯氨酸为起始原料,利用经典的二肽合成方法,用DCC将4-羟基-L-脯氨酸与各种含有疏水侧链的氨基酸缩合得到类二肽化合物。在此基础上,将1-位的甲酯水解得到羧基或者直接转化为异羟肟酸基团,得到一个系列的化合物。然后经过一系列甲磺酰化、叠氮化、氢化还原反应将4-位的羟基转化为构型翻转的氨基,再将甲酯水解得到羧基或者直接转化为异羟肟酸基团得到另两个系列的化合物。再将上述各系列化合物N-位的叔丁氧羰基脱掉,得到一个系列化合物,最后再进行氨基的乙酰化得到另一系列化合物。第二个系列水杨酸衍生物以对氨基水杨酸为起始原料,先将其1-位羧基进行酯化保护,4-位的氨基进行乙酰化,再将2-位的羟基通过醚化反应引入各种疏水性侧链,然后在3-位和5-位通过硝化引入硝基,再经过氢化还原和胍基化得到相应的氨基和胍基的衍生物。所有的目标化合物均未见国内外文献报道,其结构通过傅立叶变换红外光谱、核磁共振氢谱及电喷雾质谱确证。第四部分目标化合物的活性评价我们对所合成的两个系列共94个化合物进行了体外神经氨酸酶抑制活性评价,并挑选部分体外抑酶活性较好的化合物进行了抗病毒活性测定。测试结果表明:所有的化合物均具有一定程度的神经氨酸酶抑制活性,每个系列中均有10个左右的化合物活性与阳性对照相当甚至更好。其中第一系列中,化合物9-B3、11-B5、12-B6、23-D5和35-F5的活性较好,比较接近阳性对照的水平:第二个系列中58-J4、59-J5、64-K5、79-N5、84-05和89-P5六个化合物的活性较好,高于阳性对照的活性。综上所述,本研究以流感病毒神经氨酸酶为靶点,首先通过计算机辅助药物设计工具确定酶的活性中心对抑制剂药效团的构象要求,在文献调研和活性初筛的基础上,选择N-乙酰-L-羟脯氨酸和对氨基水杨酸作为先导化合物,结合计算机辅助药物设计进行合理药物设计。我们设计、合成了2个系列共94个新型的吡咯烷和水杨酸类流感病毒神经氨酸酶抑制剂,其结构经过质谱、核磁共振氢谱和红外光谱确证。本研究所设计的合成路线科学合理,原料经济易得。通过体外抑酶活性筛选,发现我们所合成的化合物均具有一定程度的神经氨酸酶抑制活性,其中每个系列均有10个左右化合物活性与阳性对照相当甚至更好。在此基础上我们以所设计、合成的化合物为对象,用SYBYL工作站模拟酶与抑制剂分子的相互作用,精确解析了酶与抑制剂分子的作用位点和作用模式。同时我们也进行了定量构效关系研究,建立了具有较高预测能力的定量构效关系模型,用于进一步指导基于结构的神经氨酸酶抑制剂的设计与合成。