牛白血病胶体金免疫层析诊断方法初步建立

论文摘要

牛白血病（Bovine leukemia, BL）是由牛白血病病毒（Bovine leukemia virus, BLV）引起的、以淋巴细胞恶性增生为特征的一种慢性肿瘤性疾病,全世界多数养牛国家均有发生,且有逐渐蔓延趋势。BL的危害主要是引起奶产量和繁殖性能下降,目前无有效疫苗,主要控制措施是扑杀或隔离感染牛。因此,建立快速、敏感、特异的诊断方法尤为必要。本研究根据BLV GP51基因序列设计一对引物,从BLV感染羊胎肾细胞提取DNA,用PCR扩增出预期大小的gp51片段。将扩增片段插入pMD-18T载体,经序列测定证明正确后,再插入原核表达载体pET-32a（+）,获得的重组大肠杆菌经IPTG诱导后,经SDS-PAGE证明重组蛋白以包涵体形式表达。Western-blotting显示,表达的重组蛋白能与BLV阳性血清特异反应,说明表达的gp51重组蛋白表达正确。从重组菌中分离包涵体,经尿素变性和复性后过Ni柱,获得了纯化的His-gp51融合蛋白。用纯化的重组抗原包被酶标板进行间接ELISA,证明可有效区分BLV阳性与阴性血清。在此基础上,将纯化的His-gp51融合蛋白和羊抗牛IgG点样于硝酸纤维膜上,分别作为捕获BLV抗体的检测线（T线）和捕获牛IgG的质控线（C线）,将胶体金标记的羊抗牛IgG（Fc）抗体吸附于玻璃纤维制成金标垫,从而组装成胶体金试纸条。当BLV阳性血清与玻璃纤维接触后,金标抗体则与其中的IgG结合,形成金标抗原抗体复合物,通过毛细作用移行至T线处,其中的抗BLV GP51 IgG可被重组GP51捕获,从而出现红色条带,未被捕获的金标抗原抗体复合物继续移行至C线处,其抗原抗体复合物又可被羊抗牛IgG抗体所捕获,亦出现红色条带。实验结果显示,胶体金标记羊抗牛IgG（Fc）抗体最佳标记量为6μg/ml,10min内即可获得检测结果。用初步建立的牛白血病血清抗体的间接胶体金免疫层析检测方法（GICA）对22份临床样品进行了检测,结果与美国IDEXX公司ELISA试剂盒相比,阳性符合率为88.89%（8/9）,阴性符合率为84.62%（11/13）。

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中文摘要

ABSTRACT

符号说明

综述一牛白血病研究进展

综述二胶体金免疫层析技术研究进展

研究内容一牛白血病病毒GP51 的克隆与原核表达

1 试验材料

2 方法

3 结果

4 分析与讨论

研究内容二牛白血病抗体胶体金免疫层析检测法的建立