抗菌肽PMAP-37基因的克隆、序列分析、表达及生物学功能研究

论文摘要

为研究抗菌肽基因原核表达及其生物学功能，根据GenBank上发表的猪骨髓源抗菌肽PMAP-37基因序列设计引物,从新鲜猪小肠中提取total RNA，采用RT-PCR技术，扩增出PMAP-37基因并进行序列分析。克隆片断经BamHI/EcoRI双酶切后连接到经相同酶切的pBV220质粒上，构建pBV220-PMAP37重组原核表达载体，转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆菌进行温度诱导表达并进行SDS-PAGE分析；应用乙酸浸提、乙醇浸提、甲醇浸提、离子层析等不同方法提取天然抗菌肽，研究其生物学功能；选择提取的绵羊白细胞抗菌肽进行动物实验，研究其对鸡大肠杆菌性疾病的治疗效果。琼脂糖凝胶电泳显示PMAP-37扩增片段约为500bp，序列分析表明其大小516bp，开放阅读框架504bp，与参考序列同源性99.6%；pBV220-PMAP37重组原核表达载体构建成功，温度诱导表达后经SDS-PAGE分析未得到目的蛋白，可推断原核表达系统不适用于抗菌肽PMAP-37的基因表达；提取得到4种具有明显抗菌活性的天然抗菌肽，其中以绵羊白细胞抗菌肽阳离子峰洗脱液的活性最高；生物学功能分析表明，绵羊白细胞抗菌肽可耐受一定时间的高温处理，其活性随着pH值升高而降低，能耐受胰蛋白酶、胃蛋白酶的消化处理，其抗菌能力较链霉素、青霉素要高，但不及氟苯尼考；动物实验发现，白细胞抗菌肽对肉鸡大肠杆菌疾病有良好的治疗效果。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 抗菌肽结构与分类
• 1.1.1 抗菌肽的构成特点及其基因结构
• 1.1.2 抗菌肽分类
• 1.1.2.1 据抗菌肽生物合成途径分类
• 1.1.2.2 据抗菌肽三维结构分类
• 1.1.2.3 据抗菌肽分布分类
• 1.2 抗菌肽的作用机理
• 1.2.1 抗菌肽的抗细菌作用
• 1.2.1.1 细胞膜攻击机制
• 1.2.1.2 线粒体攻击作用
• 1.2.1.3 抗菌肽的免疫调节活性
• 1.2.1.4 其它机制
• 1.2.2 抗菌肽的抗真菌作用
• 1.2.3 抗菌肽的抗肿瘤作用
• 1.2.4 抗菌肽的抗病毒作用
• 1.2.4.1 抗菌肽抗病毒的膜攻击机制
• 1.2.4.2 抗菌肽抑制病毒基因表达
• 1.2.5 抗菌肽的抗寄生虫作用
• 1.2.6 抗菌肽的协同作用
• 1.3 抗菌肽的生产
• 1.3.1 提取天然抗菌肽
• 1.3.2 化学合成抗菌肽
• 1.3.3 利用基因工程生产抗菌肽
• 1.3.3.1 抗菌肽原核表达策略
• 1.3.3.2 抗菌肽真核表达策略
• 1.4 抗菌肽的应用概况
• 1.4.1 抗菌肽的转基因研究
• 1.4.2 抗菌肽在医疗方面的应用
• 1.4.3 抗菌肽在农业上的应用
• 1.4.4 抗菌肽在养殖业中的应用
• 1.5 小结
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 载体与菌株
• 2.1.3 试剂
• 2.1.3.1 酶
• 2.1.3.2 常规试剂
• 2.1.3.3 RNA 提取用试剂
• 2.1.3.4 大肠杆菌感受态细胞制备、转化及诱导用液
• 2.1.3.5 质粒 DNA 提取用液
• 2.1.3.6 琼脂糖凝胶电泳所用溶液
• 2.1.3.7 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳所用溶液
• 2.1.3.8 细胞培养用溶液
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 引物设计及合成
• 2.2.2 total RNA 提取
• 2.2.3 PMAP-37 基因的 RT-PCR 扩增
• 2.2.4 扩增产物的纯化
• 2.2.5 重组测序质粒 PMD19-T Simple-PMAP37 的构建
• 2.2.5.1 纯化后扩增产物与 pMD19-T simple 测序载体的连接
• 2.2.5.2 连接产物的转化
• 2.2.6 重组测序质粒 PMD19-T Simple-PMAP37 的筛选和初步鉴定
• 2.2.6.1 重组测序质粒小量提取-碱裂解法
• 2.2.6.2 重组测序质粒的双酶切鉴定
• 2.2.7 序列分析
• 2.2.8 重组表达质粒 pBV220-PMAP37 构建
• 2.2.9 重组表达质粒 pBV220-PMAP37 的筛选和初步鉴定
• 2.2.10 基因工程重组菌的诱导表达
• 2.2.11 SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）
• 2.2.11.1 制胶
• 2.2.11.2 上样与电泳
• 2.2.11.3 染色与脱色
• 2.2.12 表达产物纯化
• 2.2.12.1 发酵
• 2.2.12.2 表达产物的纯化、复性
• 2.2.13 天然抗菌肽提取
• 2.2.13.1 猪小肠抗菌肽提取
• 2.2.13.2 提取绵羊白细胞抗菌肽
• 2.2.14 抗菌肽生物学功能分析
• 2.2.14.1 抑菌活性分析
• 2.2.14.2 高温对抗菌肽抑菌活性的影响
• 2.2.14.3 pH 值对抗菌肽抑菌活性的影响
• 2.2.14.4 蛋白酶对抗菌肽的抑菌活性的影响
• 2.2.14.5 抗菌肽与抗生素抑菌活性的比较
• 2.2.15 动物实验
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 实验结果
• 3.1.1 total RNA 提取
• 3.1.2 PMAP-37 基因的 RT-PCR 扩增结果
• 3.1.3 扩增产物的纯化
• 3.1.4 重组测序质粒 PMD19-T Simple-PMAP37 的构建和初步鉴定
• 3.1.5 序列分析
• 3.1.6 重组表达质粒pBV220-PMAP37构建和初步鉴定
• 3.1.7 诱导后基因工程重组表达菌的 SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 3.1.8 白细胞抗菌肽蛋白电泳及浓度测定
• 3.1.9 抗菌肽的生物学功能分析
• 3.1.9.1 抗菌肽的抑菌活性
• 3.1.9.2 高温对抗菌肽的抑菌活性的影响
• 3.1.9.3 pH 值对抗菌肽的抑菌活性的影响
• 3.1.9.4 蛋白酶对抗菌肽的抑菌活性的影响
• 3.1.9.5 天然抗菌肽与抗生素抑菌活性的比较
• 3.1.10 动物实验观测结果
• 3.2 讨论
• 第四章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录 A 英文缩写表
• 附录 B 原核表达载体 pBV220 的图谱
• 附录 C 在读期间发表论文