论文摘要
目的:现已知原癌基因Bmi-1决定着白血病干细胞及乳腺癌干细胞的自我更新能力,该基因主要通过负性调控INK4a/ARF位点调节细胞的增殖和衰老。近年来发现Bmi-1基因在多种恶性肿瘤中表达上调,其中包括肺癌。研究表明Bmi-1基因有望成为肿瘤治疗的新的靶点,从肿瘤干细胞水平抑制肿瘤的发生和发展。本研究选择高表达Bmi-1基因但INK4a/ARF位点缺失的人肺腺癌细胞系A549细胞作为研究对象,通过转染反义Bmi-1表达载体进入A549细胞,使Bmi-1蛋白表达下调,以观察其对A549细胞的抑制作用,从而探讨Bmi-1基因在INK4a/ARF位点缺失的情况下调节细胞增殖的作用机理。方法:1、将反义Bmi-1基因表达质粒转染进入肺腺癌细胞系A549细胞,用G418进行筛选得到阳性克隆,并检测阳性克隆中Neo基因的表达。2、应用Western blot及实时荧光定量RT-PCR方法检测转染后Bmi-1蛋白及mRNA的表达。3、应用MTT比色法、台盼蓝拒染法及平板克隆形成实验检测反义Bmi-1 RNA对A549细胞增殖的抑制作用。4、利用流式细胞仪分析各组细胞的细胞周期及凋亡情况。5、应用Western Blot检测细胞中p53及Rb蛋白的表达情况。6、应用Transwell试验检测反义Bmi-1 RNA对A549细胞迁移的抑制作用。结果:1、转染空质粒及反义Bmi-1基因质粒的细胞中均有Neo基因表达。2、反义Bmi-1 RNA使A549细胞中Bmi-1蛋白表达减少了95%,但不影响Bmi-1 mRNA的表达。3、反义Bmi-1 RNA使A549细胞生长速度减慢。4、反义Bmi-1 RNA使A549细胞阻滞在G0/G1期,但未引起细胞凋亡。5、转染反义Bmi-1 RNA的A549细胞中低磷酸化的Rb蛋白表达增多。6、反义Bmi-1 RNA抑制A549细胞的迁移。结论:反义Bmi-1 RNA在体外对A549细胞增殖有明显的抑制作用,并抑制了A549细胞的迁移。反义Bmi-1 RNA对A549细胞增殖的抑制作用是通过将细胞阻滞在G0/G1期实现的,但这种抑制作用不是通过INK4a/ARF位点起作用,而是Bmi-1基因表达下调后,通过间接机制使低磷酸化Rb蛋白增多,使A549细胞阻滞在G0/G1期。
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