用于呼吸道基因输送的气雾剂研究

论文摘要

病毒性呼吸道传染疾病已成为全球范围内一个严重的公共健康安全问题。基因疗法可能成为新的有效的抗病毒治疗策略。为达到好的基因治疗效果,特别是针对呼吸道疾病的基因疗法,必须找到有效的输送载体和运载方法。目前研究较多的非病毒载体,如脂质体和胶束,均为水溶性,不能与气雾剂中的抛射剂互溶,大大限制了气雾剂在呼吸道疾病中的应用。针对以上问题,需制备可与抛射剂互溶的制剂,并在实现呼吸道广泛分布的同时提高基因表达。本文发展了一种新型的脂质基因复合物。我们首先采用油水两相萃取系统,从有机相中萃取出通过静电作用结合的质粒DNA与脂质CDAN的复合物（反相胶束）,然后对该制剂进行了表征。通过凝胶电泳法结合紫外分光光度法测定其萃取率,用激光粒度测定仪测定粒径,并采用原子力显微镜观察反相胶束的形态。实验结果表明,该制剂中质粒DNA的携带率在80%以上,光强分布平均粒径为150nm,可很好地溶于无水乙醚,分散到氟利昂抛射剂中得到澄明溶液。在灌装为耐压定量气雾剂后,该制剂可随抛射剂形成的气雾喷出。进一步的,我们根据《中国药典》2005版二部规定的方法,考察了该反相胶束气雾剂的雾滴大小、喷雾形态、每揿重量、气雾剂的内容物比例、体外分布等。结果显示,该气雾剂可达到定量要求,雾滴颗粒大小在15μm之间。之后,我们进行了反相胶束气雾剂在细胞和动物模型中的基因转染实验,证明了其在保证细胞存活率的同时,具有高转染效率。体外人体呼吸道模型的分布实验结果显示了该气雾剂的广泛分布性。在动物体内分布实验中,荧光成像结果显示,该反相胶束气雾剂可广泛分布于小鼠的呼吸道和肺部。细胞和动物体内转染实验均证实了该制剂可以有效提高报道基因在呼吸道上皮细胞的表达量。本论文解决了目前大部分基因载体不能与抛射剂互溶的问题,制备了一种新型的脂质-DNA复合物,能够在保证基因完整有效的同时,提高其转染效率。另外,采用定量气雾剂更加方便,而且可以使内容物在呼吸道达到有效分布。因此,本研究为病毒性呼吸道疾病的预防和治疗提供了具有前景的新型脂质输送载体和方法。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1 呼吸道病毒性疾病
• 2 基因药物在呼吸道病毒疾病治疗中的应用
• 2.1 基因药物概述
• 2.2 基因药物在呼吸道病毒疾病治疗中的应用
• 2.3 基因药物输送载体及其在呼吸道输送中的应用
• 3 基因药物的呼吸道给药制剂研究
• 3.1 吸入制剂概述及分类
• 3.2 耐压定量气雾剂（Pressurized metered dose inhaler，pMDI）
• 4 研究的目的与内容
• 第二章反相胶束气雾剂的制备及处方优化
• 1 引言
• 2 实验材料及仪器
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验仪器
• 3 实验方法与结果
• 3.1 质粒DNA（pGL3）的提取、分离和纯化
• 3.2 DOTAP/DNA 反相胶束的处方摸索
• 3.3 CDAN/DNA 反相胶束的基本制备方法
• 3.4 CDAN/DNA 反相胶束的表征和处方工艺考察
• 3.5 CDAN/DNA 反相胶束气雾剂的制备
• 3.6 CDAN/DNA 反相胶束气雾剂的表征
• 4 分析与讨论
• 4.1 CDAN/DNA 反相胶束的处方及制备方法的确定
• 4.2 气雾剂的确定
• 第三章反相胶束气雾剂的体外研究
• 1 引言
• 2 实验材料与仪器
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验仪器
• 3 实验方法
• 3.1 细胞培养
• 3.2 CDAN 脂质体的制备
• 3.3 细胞毒性实验
• 3.4 细胞转染
• 3.5 统计分析
• 4 结果
• 4.1 以无水乙醚为溶剂的CDAN/DNA 反相胶束提高质粒 DNA 对细胞的转染效率
• 4.2 CDAN/DNA 反相胶束气雾剂提高质粒DNA 对细胞的转染效率
• 5 讨论
• 第四章 反相胶束气雾剂的体内研究
• 1 引言
• 2 实验材料与仪器
• 3 实验方法
• 3.1 Cy5.5 标记CDAN/DNA 反相胶束气雾剂的制备
• 3.2 实验动物处理和给药
• 3.3 动物体内荧光分布的测定
• 3.4 动物呼吸道转染效率的测定
• 3.5 统计分析
• 4 实验结果
• 4.1 基于图像处理方法得到的动物呼吸道分布的结果
• 4.2 动物呼吸道上皮细胞转染结果
• 5 讨论
• 第五章总结与展望
• 5.1 主要结论
• 5.2 研究展望
• 参考文献
• 致谢