半夏内生菌Pseudomonas Aeruginosa pY11T-3-1生防效果及活性成分分析

论文摘要

半夏（Pinellia ternata（Thunb.）Breit.）是天南星科的一种重要的传统药用植物。生物防治是预防半夏等中药材病害的首选方法。本论文针对栽培半夏中发病较高的软腐病,对前期所分离的半夏高效内生菌——铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa） pY11T-3-1进行初步应用研究,并探索活性成分的分离纯化及初步鉴定方法。首先,对生防菌P. aeruginosa pY11T-3-1进行了植株软腐病防治、促生长和室内安全生测等试验。结果,生防菌P. aeruginosa pY11T-3-1可在半夏、番茄、白菜等植物中稳定定殖,并有效抑制这些植物的软腐病发生,生防效果在80%以上。促生长试验表明生防菌P. aeruginosa pY11T-3-1对3种植物的发芽率、发芽势、株高、鲜重及日增长量具有一定的促进作用。室内安全性生测结果表明,高浓度生防菌P. aeruginosa pY11T-3-1抑制植物生长,中低浓度则促进植物生长。可见,适宜浓度的生防菌对植物不仅安全无害,而且还具有一定的促进作用,在实际生产中具有较好的应用潜力。其次,初步优化了生防菌P. aeruginosa pY11T-3-1活性成分产生的最佳条件。单因子发酵条件试验表明,生防菌发酵产生活性成分的最佳条件为:140ml装液量、pH 7.0发酵液、10%接种量、30℃培养24-48h。按照此条件,成功地在发酵罐培养了P. aeruginosa pY11T-3-1。耐受性检测表明,该菌的生防活性成分对高温、碱性环境的耐受性较强,冷冻干燥和真空干燥对其活性影响较小。因此,可采用冷冻干燥对发酵液进行干燥浓缩。最后,探索了生防菌的分离、纯化及鉴定方法。膜与理化分离结果表明,PW4040F型超滤陶瓷膜可有效地对生防菌P. aeruginosa pY11T-3-1发酵液中的活性成分进行分离,其对发酵液中杂质截留量及膜清洗后通量恢复率分别为89.5%、92.9%;DK4040F型纳滤膜对超滤液中的活性成分的效价进一步浓缩,浓缩倍数为,浓缩液的含固率为1.81%;乙酸乙酯则可对该菌的活性成分进行高效萃取。可见,膜分离和溶剂萃取菌可用于活性成分的初步分离,膜分离适用于大量制备,乙酸乙酯萃取适用于小规模操作。对以上初步分离物进行纯化与初步鉴定。薄层层析结果表明,正己烷:乙酸乙酯（85:15）的分离效果最佳,分离条带为3-5条。用此溶剂系统,对粗提物ASW进行硅胶柱分离,获得具有抑菌活性的分离物ASW20-30,其中分离物ASW20的抑菌活性最强。高效液相色谱分析发现,用甲醇:水（=70:30）作流动相,分离物ASW20可以进行较好地分离,获得2个主峰,峰面积分别为42.2%、36.71%;质谱鉴定,相应地得到2个主峰ASN206和ASN207,其保留时间分别为46.20 min、6.77 min,相对分子量分别为259、271,结合文献初步确定分离物ASN206和ASN207分别为吡咯特林（pyoluteorin）和吡咯尼群（pyrronitrin）。此外,尚可确定分子量的产物9种,对于这些物质的特性有待进一步分析。综上所述,兼具促生和防病双重功效的安全生防菌,P. aeruginosa pY11T-3-1在实际生产中具有潜在的应用开发价值,生所建立的分离、纯化及初步鉴定方法对该菌的应用研究提供了理论依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 半夏研究概况
• 1.1 半夏生物学特性
• 1.2 半夏栽培及其病害
• 1.2.1 基腐病
• 1.2.2 病毒病
• 1.2.3 叶斑病
• 1.2.4 烫叶病
• 1.2.5 软腐病
• 2 生物防治现状
• 2.1 天然提取物
• 2.2 根际生防菌
• 2.3 内生生防菌
• 2.3.1 内生生防细菌
• 2.3.2 内生生防真菌
• 2.3.3 内生生防放线菌
• 3 荧光类假单胞菌的概述
• 3.1 荧光类假单胞菌种类
• 3.2 荧光类假单胞菌功能
• 3.2.1 生物降解
• 3.2.2 植物促生作用
• 3.2.3 生物防治
• 3.3 生防活性产物种类
• 3.3.1 聚酮化合物
• 3.3.2 含氮杂环化合物
• 3.3.3 苯基吡咯类化合物
• 3.3.4 其它类物质
• 3.4 生防作用机制
• 3.4.1 抗生素合成作用机制
• 3.4.2 诱导系统抗性介导机制
• 3.4.3 群体感应介导机制
• 3.5 荧光类假单胞菌生物防治研究
• 4 微生物活性成分的分离纯化方法
• 4.1 溶媒萃取技术
• 4.2 膜分离技术
• 4.2.1 膜材料及构型
• 4.2.2 膜分离技术
• 4.2.3 膜污染与清洗
• 4.3 色谱技术
• 4.3.1 薄层色谱
• 4.3.2 柱色谱
• 4.3.3 高效液相色谱
• 4.3.4 高速逆流色谱
• 5 研究内容和意义
• 第二章 生防菌P. aeruginosa pY11T-3-1 的应用初探
• 1 材料
• 1.1 实验菌株
• 1.2 材料来源
• 1.3 实验仪器
• 2 方法
• 2.1 试验材料准备
• 2.1.1 种子处理
• 2.1.2 菌液制备
• 2.2 试验设计
• 2.2.1 植物软腐病防治试验
• 2.2.2 植物促生长试验
• 2.2.3 室内安全性生测
• 2.3 检测指标
• 2.3.1 种子发芽率和发芽势
• 2.3.2 植株生长情况
• 2.3.3 拮抗菌定殖动态
• 2.3.4 病情统计及防治效果
• 3 结果与分析
• 3.1 植物软腐病防治
• 3.1.1 生防菌的定殖动态
• 3.1.2 病情统计及防治效果
• 3.2 植物促生长试验
• 3.2.1 发芽率和发芽势
• 3.2.2 植株生长情况
• 3.3 室内安全性生测
• 4 小结与讨论
• 第三章 P. aeruginosa pY11T-3-1 生防活性成分的分离纯化及鉴定
• 1 材料
• 1.1 菌株及培养条件
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 活性成分产生条件的优化及其性质初探
• 2.1.1 活性成分产生条件优化
• 2.1.2 活性成分性质初探
• 2.2 生防活性成分的分离
• 2.2.1 膜分离
• 2.2.2 理化分离
• 2.3 活性成分的纯化及初步鉴定
• 2.3.1 薄层层析
• 2.3.2 硅胶柱分离
• 2.3.3 高效液相色谱法检测
• 2.3.4 活性成分初步鉴定
• 3 结果与分析
• 3.1 活性成分的条件优化及性质初探
• 3.1.1 发酵条件优化
• 3.1.2 活性成分性质初探
• 3.2 活性成分的分离
• 3.2.1 膜分离
• 3.2.2 理化分离
• 3.3 活性成分的纯化及鉴定
• 3.3.1 薄层层析
• 3.3.2 硅胶柱层析
• 3.3.3 高效液相色谱检测
• 3.3.4 活性成分初步鉴定
• 4 小结与讨论
• 4.1 活性成分的条件优化及性质初探
• 4.2 活性成分的分离
• 4.3 活性成分的纯化及初步鉴定
• 总结
• 参考文献
• 致谢
• 附录 培养基及试剂配制
• 攻读硕士学位期间的研究成果