新型仿生纳米复合支架修复骨缺损的实验研究

论文摘要

目的评价新型仿生纳米壳聚糖—胶原（nano Chitosan-Sodium Collagen,Nano-CS-COL）支架与Sprague-Dawley（SD）大鼠骨髓基质干细胞（Bonemesenchymal stem cells,BMSCs）的体外相容性。体外构建组织工程骨并植入动物体内,以评价修复节段性胫骨缺损的效果,初步探讨治疗骨缺损的新组织工程学方法。方法本课题应用骨组织工程原理,将骨髓间充质干细胞（BMSCs）进行体外扩增,然后种植在纳米复合材料上,加入成骨诱导液,观察种子细胞在复合材料上的生长情况以及与材料的生物形容性,体外形成组织工程骨后进而进行SD大鼠胫骨骨缺损的修复。分离培养SD大鼠BMSCs,对细胞表面抗原进行检测;相差显微镜观察细胞形态。聚电解质共凝聚技术（Polyelectrolyte complex coacervation）制作nano-CS＼COL支架,取生长良好的P3代细胞,与nano-CS＼COL支架体外联合诱导培养,通过细胞粘附率、生长曲线、细胞活力、周期、细胞Ⅰ型胶原染色、扫描电镜观察综合评价材料与细胞的相容性。将Nano-CS-COL/BMSCs复合物种植入大鼠的胫骨缺损内,术后6、12周进行标本的大体观察、X线放射学、组织学,对比实验组与对照组、空白组骨缺损修复情况结果BMSCs可在体外分离扩增,表达CD29、CD44和CD106,不表达CD34和CD45,细胞形态为长梭形,nano-CS＼COL平均孔径为150μm,与BMSCs有较好的相容性。术后6、12周实验组与实验对照组放射学检查评价新骨生成有显著性差异（P＜0.05）。术后组织学检查新骨生成速度、生成量均有显著性差异。实验组完全修复骨缺损,对照组部分修复,空白不能自行修复骨损,最后缺损由纤维组织充填。结论1.BMSCs可在体外长期、稳定培养;是理想的组织工程种子细胞;nano-CS＼COL与BMSCs有良好的相容性2.BMSCs/nano-CS-COL复合物植入修复鼠胫骨缺损能够加速新骨形成,可以达到修复骨缺损的目的。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 骨组织工程学概况
• 1.2 种子细胞
• 1.2.1 BMSCs的生物学特性
• 1.2.2 BMSCs的分离纯化
• 1.2.3 BMSCs的细胞形态及增殖特点
• 1.2.4 BMSCs的免疫表型及其鉴定
• 1.2.5 BMSCs的成骨诱导及鉴定
• 1.3 支架材料
• 1.3.1 纳米仿生复合支架的应用现状
• 1.3.2 NANO-CS-COL支架的优缺点及改进
• 1.4 关于骨缺损动物模型
• 1.5 课题研究思路及目的
• 1.6 实验的研究内容
• 1.7 创新点
• 2 实验一 BMSCS体外培养向成骨和成软骨定向诱导的研究
• 2.1 研究目的
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 实验动物
• 2.2.2 实验动物分组
• 2.2.3 主要试剂
• 2.2.4 实验仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 实验试剂的配制
• 2.3.2 NANO-CS/COL支架制备、扫描电镜观察、质量法测定其孔隙率
• 2.3.3 SD大鼠BMSCs的获取、培养、鉴定
• 2.3.4 BMSCs与NANO-CS-COL支架复合
• 2.3.5 细胞黏附性的观察
• 2.3.6 A、B、C三组细胞生长曲线的绘制
• 2.3.7 诱导培养的BMCs免疫组织化学染色
• 2.3.8 A、C两组细胞周期及活力的对比
• 2.3.9 细胞复合材料后形态观察
• 2.4 统计方法
• 2.5 结果
• 2.5.1 NANO-CS-COL支架扫描电镜观察
• 2.5.2 BMSCS形态学观察
• 2.5.3 BMSCS的鉴定
• 2.5.4 诱导培养的BMCS免疫组织化学染色
• 2.5.5 细胞贴壁率
• 2.5.6 细胞生长曲线的绘制、细胞周期及活力检测
• 2.5.7 细胞复合材料后形态观察
• 2.6 讨论
• 2.7 结论
• 2.8 附图
• 3 实验二 仿生纳米复合支架修复大鼠胫骨缺损的实验研究
• 3.1 实验目的
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 实验动物
• 3.2.2 动物模型标本的选择
• 3.2.3 主要试剂和仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 BMSCS的体外培养及扩增
• 3.3.2 NANO-CS-COL支架制备
• 3.3.3 BMSCS与NANO-CS-COL支架复合、培养
• 3.3.4 骨缺损模型制备与修复
• 3.3.5 动物术后观察
• 3.4 统计方法
• 3.5 结果
• 3.5.1 BMSCs的体外培养及扩增
• 3.5.2 术后SD大鼠的情况
• 3.5.3 各组标本大体观察
• 3.5.4 X-RAY检查结果
• 3.5.5 术后细胞支架复合组织HE染色
• 3.6 讨论
• 3.7 结论
• 3.8 附图
• 4 英文缩略词
• 5 参考文献
• 6 发表论文
• 7 致谢