论文摘要
土壤盐渍化及钾素匮乏是影响植物生长发育的重要因素。盐渍化和低钾双重胁迫下,维持植物体内离子稳态,提高植物耐盐性和耐低钾能力至关重要。高亲和钾离子转运蛋白负责低钾环境中钾离子吸收,在高盐环境中,Na+敏感型的钾离子转运蛋白的活性受到抑制,而Na+不敏感型高亲和钾离子转运蛋白受到影响较小。推测在高盐环境中,Na+不敏感的钾离子转运蛋白能更好地发挥钾离子吸收作用,同时提高植物耐盐性。目前,已从盐生植物分离得到了Na+不敏感钾离子转运蛋白基因。盐角草是世界上最为耐盐的双子叶盐生植物之一,本研究目的在于从盐角草中获得对Na+不敏感的钾离子转运蛋白基因SeHAKl,期望它能够在低钾环境中高效地介导钾离子吸收,并能够提高转基因植株耐盐能力。本实验利用RT-PCR、RLM-RACE和锚定PCR技术获得了2706bp的SeHAKl,其中含249bp的5’UTR,96bp的3’UTR及2361bp的编码区,其编码786个氨基酸的蛋白。同源性分析表明,SeHAKl与报道的HAK家族同源性达到40%-77%。系统进化树分析表明,SeHAKl属于HAK/KUP/KT的第二类亚家族。氨基酸疏水性分析表明SeHAKl具有14个跨膜结构域。基因表达模式分析表明,SeHAKl在盐角草根部组织、茎部组织均有转录水平表达;在未经胁迫处理、高盐胁迫和低钾处理的盐角草中,均可检测到SeHAKl基因表达。将SeHAKl的编码区构建到酵母表达载体pYES2.0中,利用电击转化将重组质粒导入到酵母菌株W△3中,通过营养缺陷型筛选出转基因酵母WA3-SeHAKl。酵母互补表明在100μMK+的培养基中WA3-SeHAKl可以正常生长,但在含有Cs+、Rb+的培养基中生长受到抑制,在高浓度Na+环境中,WA3-SeHAKl受到的影响较小。钾离子耗竭实验表明在外界钾离子浓度为100μMK+条件下,WA3-SeHAKl的钾离子吸收速率高于W△3,其Km值为3.8μM,介导高亲和钾离子转运。在外界钾离子浓度为10mMK+的条件下,WA3-SeHAKl的钾离子吸收速率高于W△3,表明SeHAKl也介导低亲和钾离子吸收。
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摘要Abstract引言1 文献综述1.1 钾营养与土壤缺钾概况1.1.1 钾营养概况1.1.2 土壤缺钾及钾矿概况1.2 土壤盐渍化及其对植物的影响1.2.1 土壤盐渍化概况1.2.2 盐渍化土壤对植物的影响1.3 植物体内离子稳态机制1.4 钾离子转运系统研究1.4.1 钾离子通道1.4.2 钾离子转运蛋白1.5 盐角草及其耐盐机制研究1.5.1 盐角草简介1.5.2 盐角草的耐盐机制1.6 研究目的与意义2 盐角草SeHAK1基因克隆与序列分析2.1 实验材料与设备2.1.1 实验材料2.1.2 实验试剂2.1.3 主要仪器2.1.4 菌株及培养基2.2 实验方法2.2.1 Trizol法提取盐角草总RNA2.2.2 盐角草SeHAK1基因部分编码区的克隆2.2.3 RLM-RACE法克隆盐角草SeHAK1 3’cDNA2.2.4 利用锚定PCR法获得SeHAK1 5’cDNA2.2.5 盐角草SeHAK1基因cDNA全长的获得2.2.6 盐角草SeHAK1编码区克隆2.2.7 SeHAK1编码区的生物信息学分析2.3 结果与分析2.3.1 盐角草RNA的完整性2.3.2 盐角草SeHAK1基因部分编码区的克隆2.3.3 盐角草SeHAK1基因3’cDNA克隆2.3.4 盐角草SeHAK1基因5’cDNA克隆2.3.5 盐角草SeHAK1基因编码区获得2.3.6 盐角草SeHAK1编码区生物信息学分析2.4 讨论2.5 小结3 SeHAK1在盐角草中表达模式分析3.1 实验材料与设备3.1.1 实验材料3.1.2 实验试剂3.1.3 实验设备3.2 实验方法3.2.1 不同处理条件下SeHAK1在盐角草幼苗中表达分析3.2.2 不同处理条件下SeHAK1在盐角草成苗中的表达分析3.2.3 SeHAK1在盐角草成苗不同组织中表达分析3.3 结果与分析3.3.1 不同处理条件下盐角草幼苗RNA完整性3.3.2 不同处理条件下SeHAK1基因在盐角草幼苗中的表达3.3.3 不同处理条件下盐角草成苗中RNA完整性3.3.4 不同处理条件下SeHAK1在成苗盐角草中的表达分析3.3.5 盐角草成苗不同组织中RNA完整性3.3.6 SeHAK1在盐角草成苗不同组织中的表达3.4 讨论3.5 小结4 酵母表达载体构建、遗传转化及功能分析4.1 实验材料4.1.1 质粒和菌种4.1.2 实验试剂4.1.3 实验仪器4.1.4 培养基4.2 实验方法4.2.1 pYES表达载体及pMD19T-SeHAK1的获取4.2.2 目的片段与酵母表达载体的连接4.2.3 重组质粒的酵母遗传转化4.2.4 转化酵母的分子检测4.2.5 转化酵母的功能分析4.3 结果与分析4.3.1 目的基因与pYES表达载体的连接4.3.2 重组质粒pYES-SeHAK1酵母遗传转化4.3.3 转SeHAK1酵母功能分析4.4 讨论4.5 小结结论参考文献附录A 论文中所用的DNA Marker附录B 论文中所用的质粒图谱附录C Hoagland营养液培养配方攻读硕士学位期间发表学术论文情况致谢
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盐角草高亲和K+转运蛋白基因SeHAK1克隆与功能分析
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