盐角草高亲和K+转运蛋白基因SeHAK1克隆与功能分析

盐角草高亲和K+转运蛋白基因SeHAK1克隆与功能分析

论文摘要

土壤盐渍化及钾素匮乏是影响植物生长发育的重要因素。盐渍化和低钾双重胁迫下,维持植物体内离子稳态,提高植物耐盐性和耐低钾能力至关重要。高亲和钾离子转运蛋白负责低钾环境中钾离子吸收,在高盐环境中,Na+敏感型的钾离子转运蛋白的活性受到抑制,而Na+不敏感型高亲和钾离子转运蛋白受到影响较小。推测在高盐环境中,Na+不敏感的钾离子转运蛋白能更好地发挥钾离子吸收作用,同时提高植物耐盐性。目前,已从盐生植物分离得到了Na+不敏感钾离子转运蛋白基因。盐角草是世界上最为耐盐的双子叶盐生植物之一,本研究目的在于从盐角草中获得对Na+不敏感的钾离子转运蛋白基因SeHAKl,期望它能够在低钾环境中高效地介导钾离子吸收,并能够提高转基因植株耐盐能力。本实验利用RT-PCR、RLM-RACE和锚定PCR技术获得了2706bp的SeHAKl,其中含249bp的5’UTR,96bp的3’UTR及2361bp的编码区,其编码786个氨基酸的蛋白。同源性分析表明,SeHAKl与报道的HAK家族同源性达到40%-77%。系统进化树分析表明,SeHAKl属于HAK/KUP/KT的第二类亚家族。氨基酸疏水性分析表明SeHAKl具有14个跨膜结构域。基因表达模式分析表明,SeHAKl在盐角草根部组织、茎部组织均有转录水平表达;在未经胁迫处理、高盐胁迫和低钾处理的盐角草中,均可检测到SeHAKl基因表达。将SeHAKl的编码区构建到酵母表达载体pYES2.0中,利用电击转化将重组质粒导入到酵母菌株W△3中,通过营养缺陷型筛选出转基因酵母WA3-SeHAKl。酵母互补表明在100μMK+的培养基中WA3-SeHAKl可以正常生长,但在含有Cs+、Rb+的培养基中生长受到抑制,在高浓度Na+环境中,WA3-SeHAKl受到的影响较小。钾离子耗竭实验表明在外界钾离子浓度为100μMK+条件下,WA3-SeHAKl的钾离子吸收速率高于W△3,其Km值为3.8μM,介导高亲和钾离子转运。在外界钾离子浓度为10mMK+的条件下,WA3-SeHAKl的钾离子吸收速率高于W△3,表明SeHAKl也介导低亲和钾离子吸收。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 引言
  • 1 文献综述
  • 1.1 钾营养与土壤缺钾概况
  • 1.1.1 钾营养概况
  • 1.1.2 土壤缺钾及钾矿概况
  • 1.2 土壤盐渍化及其对植物的影响
  • 1.2.1 土壤盐渍化概况
  • 1.2.2 盐渍化土壤对植物的影响
  • 1.3 植物体内离子稳态机制
  • 1.4 钾离子转运系统研究
  • 1.4.1 钾离子通道
  • 1.4.2 钾离子转运蛋白
  • 1.5 盐角草及其耐盐机制研究
  • 1.5.1 盐角草简介
  • 1.5.2 盐角草的耐盐机制
  • 1.6 研究目的与意义
  • 2 盐角草SeHAK1基因克隆与序列分析
  • 2.1 实验材料与设备
  • 2.1.1 实验材料
  • 2.1.2 实验试剂
  • 2.1.3 主要仪器
  • 2.1.4 菌株及培养基
  • 2.2 实验方法
  • 2.2.1 Trizol法提取盐角草总RNA
  • 2.2.2 盐角草SeHAK1基因部分编码区的克隆
  • 2.2.3 RLM-RACE法克隆盐角草SeHAK1 3’cDNA
  • 2.2.4 利用锚定PCR法获得SeHAK1 5’cDNA
  • 2.2.5 盐角草SeHAK1基因cDNA全长的获得
  • 2.2.6 盐角草SeHAK1编码区克隆
  • 2.2.7 SeHAK1编码区的生物信息学分析
  • 2.3 结果与分析
  • 2.3.1 盐角草RNA的完整性
  • 2.3.2 盐角草SeHAK1基因部分编码区的克隆
  • 2.3.3 盐角草SeHAK1基因3’cDNA克隆
  • 2.3.4 盐角草SeHAK1基因5’cDNA克隆
  • 2.3.5 盐角草SeHAK1基因编码区获得
  • 2.3.6 盐角草SeHAK1编码区生物信息学分析
  • 2.4 讨论
  • 2.5 小结
  • 3 SeHAK1在盐角草中表达模式分析
  • 3.1 实验材料与设备
  • 3.1.1 实验材料
  • 3.1.2 实验试剂
  • 3.1.3 实验设备
  • 3.2 实验方法
  • 3.2.1 不同处理条件下SeHAK1在盐角草幼苗中表达分析
  • 3.2.2 不同处理条件下SeHAK1在盐角草成苗中的表达分析
  • 3.2.3 SeHAK1在盐角草成苗不同组织中表达分析
  • 3.3 结果与分析
  • 3.3.1 不同处理条件下盐角草幼苗RNA完整性
  • 3.3.2 不同处理条件下SeHAK1基因在盐角草幼苗中的表达
  • 3.3.3 不同处理条件下盐角草成苗中RNA完整性
  • 3.3.4 不同处理条件下SeHAK1在成苗盐角草中的表达分析
  • 3.3.5 盐角草成苗不同组织中RNA完整性
  • 3.3.6 SeHAK1在盐角草成苗不同组织中的表达
  • 3.4 讨论
  • 3.5 小结
  • 4 酵母表达载体构建、遗传转化及功能分析
  • 4.1 实验材料
  • 4.1.1 质粒和菌种
  • 4.1.2 实验试剂
  • 4.1.3 实验仪器
  • 4.1.4 培养基
  • 4.2 实验方法
  • 4.2.1 pYES表达载体及pMD19T-SeHAK1的获取
  • 4.2.2 目的片段与酵母表达载体的连接
  • 4.2.3 重组质粒的酵母遗传转化
  • 4.2.4 转化酵母的分子检测
  • 4.2.5 转化酵母的功能分析
  • 4.3 结果与分析
  • 4.3.1 目的基因与pYES表达载体的连接
  • 4.3.2 重组质粒pYES-SeHAK1酵母遗传转化
  • 4.3.3 转SeHAK1酵母功能分析
  • 4.4 讨论
  • 4.5 小结
  • 结论
  • 参考文献
  • 附录A 论文中所用的DNA Marker
  • 附录B 论文中所用的质粒图谱
  • 附录C Hoagland营养液培养配方
  • 攻读硕士学位期间发表学术论文情况
  • 致谢
  • 相关论文文献

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