人溶菌酶乳腺生物反应器的初步研究

论文摘要

人溶菌酶（human lysozyme,hLYZ）能水解细菌细胞壁粘多糖的β-1,4糖苷键,所以对革兰阳性细菌具有直接的溶解作用,在分泌型免疫球蛋白A和补体的参与下对革兰氏阴性细菌具有间接的溶解作用,此外它还具有消炎、消肿、组织修复、改善组织局部血液循环和分解脓液等药理作用。因此在医学、食品工业等领域得到十分广泛的应用。为了防治奶牛乳房炎,提高奶牛的抗病能力,试图通过转基因动物的方法提高人溶菌酶在奶牛乳腺细胞中表达,以降低乳房炎的发病率。本研究在克隆出牛β-乳球蛋白基因5′调控序列的基础上,结合本实验室已克隆出人溶菌酶cDNA序列,构建人溶菌酶基因的乳腺特异表达载体pBEL,并通过电穿孔的方法研究其在体外培养的牛乳腺上皮细胞表达情况。通过G418筛选阳性细胞,为本实验室利用核移植技术生产转基因动物提供细胞来源。研究结果如下:1.利用PCR方法扩增了牛β-乳球蛋白基因5′调控成分,其中包括部分上游序列,第一外显子及第一内含子（933bp）。PCR产物回收纯化后,克隆在pMD18-T Vector的T位点。序列分析结果表明:该序列与牛β-乳球蛋白突变体B前体基因、牛β-乳球蛋白基因突变体B、牛β-乳球蛋白基因的同源性分别为99﹪、99﹪、98﹪。软件分析表明:该序列包括一些表达所需的调控成分,可用于构建乳腺表达载体。2.利用双酶切定向克隆的方法,将真核表达载体pEGFP-Cl构建成含有抗性基因、报告基因、人溶菌酶基因cDNA的真核表达载体pEGFP-hLYZ。用PCR和双酶切方法检测,表明插入的人溶菌酶基因位点正确无误,没有发生影响表达的突变。3.利用双酶切定向克隆的方法,将扩增的牛β-乳球蛋白基因的5′调控序列序列取代真核表达载体pEGFP-hLYZ的部分CMV作为启动子,构建人溶菌酶乳腺特异性表达载体pBEL,载体有抗性基因,绿色荧光蛋白报告基因。并且保证报告基因和目的基因为非融合型表达。4.采用电穿孔转化法转化牛乳腺上皮细胞,经过G418的初步筛选后,通过荧光显微镜观察到了绿色荧光。表明该载体是可用的。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 奶牛乳房炎的防治进展
• 1.1.1 奶牛乳房炎的分类及危害
• 1.1.2 奶牛乳房炎的病因及发病规律
• 1.1.3 奶牛乳房炎的诊断
• 1.1.4 奶牛乳房炎的防治
• 1.2 乳腺生物反应器的研究进展
• 1.2.1 乳腺特异表达载体的构建
• 1.2.2 影响外源基因乳腺高效表达的因素及提高的策略
• 1.2.3 转基因技术的研究
• 1.2.4 问题与展望
• 第二章 牛β-乳球蛋白基因5′调控序列的克隆及序列分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 实验结果
• 2.2.1 牛β-乳球蛋白基因5′调控序列的PCR 鉴定结果
• 2.2.2 BamHⅠ酶切鉴定的结果
• 2.2.3 序列分析结果
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 第三章 人溶菌酶乳腺特异表达载体的构建及其在牛乳腺上皮细胞中的表达
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 hLYZ 基因 PCR 扩增的结果
• 3.2.2 phLYZ，pEGFP-C1 的 BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定结果
• 3.2.3 重组质粒pEGFP－hLYZ 的鉴定
• 3.2.4 pMD-BLG，pEGFP－hLYZ 的 SnaBⅠ和NheⅠ双酶切
• 3.2.5 重组质粒pBEL 的鉴定
• 3.2.6 人溶菌酶基因的细胞表达
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介