论文摘要
鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma）是原发于鼻咽粘膜被覆上皮的恶性肿瘤,其病因涉及EB病毒感染、化学致癌物质作用及遗传变异或自发突变等多个因素,具有颈部淋巴结转移早,远处转移发生率高等特点。据最近数据显示70%的鼻咽癌患者在初诊时已经发生颈部淋巴结转移。虽然放射治疗水平和设备在不断改善,但由于个体对放疗敏感性存在差异,鼻咽癌治疗的5年生存率始终徘徊在60%-70%。远处转移和局部复发是导致鼻咽癌治疗失败的最主要原因。Flotillin-2（Flot-2）蛋白最先是从细胞膜上的caveolae/lipid raft富集区分离出来的,是组成细胞膜的重要成分,不仅参与跨膜物质转运和T、B淋巴细胞的激活,而且参与调控与细胞生长和恶性转化相关的多种下游信号传导通路,同时在维持表皮细胞的结构和粘附以及丝状伪足的形成方面起重要作用。研究表明,Flot-2具有促进黑色素瘤细胞侵袭和转移的潜能。本实验室前期工作利用抑制性消减杂交技术,以具有不同转移能力的两株鼻咽癌细胞5-8F和6-10B为材料,建立了两者间差异表达基因的消减cDNA文库并从中筛选出多个在高转移鼻咽癌细胞5-8F中的表达上调的基因。选取Flot-2并将其在5-8F细胞中进行RNA干扰后5-8F细胞生物学行为发生了一系列改变,如细胞停滞于G1期,增殖能力明显下降,侵袭能力和运动能力减弱等,提示Flot-2与鼻咽癌的转移可能有着密切联系。本研究在前期工作的基础上,通过基因转染实验使鼻咽癌细胞6-10B中Flot-2基因表达上调,并观察Flot-2基因表达上调对6-10B细胞生物学特性的影响,进一步明确Flot-2基因在促进鼻咽癌转移方面所起到的作用。实验结果如下:首先,我们采用RT-PCR方法从5-8F细胞中克隆Flot-2基因的开放阅读框序列,并将其克隆到pcDNA3.1（+）中,构建了Flot-2基因的真核表达载体（pcFlot-2）。利用脂质体转染技术将pcFlot-2导入6-10B细胞,经G418筛选获得抗性克隆,进一步采用RT-PCR检测Flot-2基因mRNA的表达,采用Western blotting检测Flot-2蛋白的表达,结果表明我们已成功地建立稳定转染pcFlot-2的6-10B细胞系（6-10B-Flot-2）。随后我们检测了Flot-2基因表达上调对6-10B细胞的生物学特性的影响。细胞形态学观察发现,细胞出现了较明显的变化,形态变得不规则,有些呈梭形,有些表现为神经元外形。细胞向外周伸展,形成明显的片状伪足,在片状伪足的边缘出现较多的膜皱褶（membraneruffles）,细胞面积变大,细胞的核浆比变小。进一步用激光共聚焦显微镜观察发现细胞表面微丝增加,变致密,微丝发生了重新分布,微丝向细胞周边延伸,形成明显的片状伪足以及位于片状伪足边缘的膜皱褶结构。流式细胞分析结果表明,与对照组相比,转染组6-10B-Flot-2细胞G0-G1期的细胞比例明显减少（48.23%vs63.28%）,S期细胞比例明显增多（35.95%vs21.10%）。平板克隆形成实验结果显示6-10B-Flot-2细胞的克隆形成能力明显高于对照组;MTT的结果表明6-10B-Flot-2细胞的增殖速度明显高于对照组。提示Flot-2基因表达上调导致6-10B细胞的克隆形成能力和增殖能力均显著增强。利用划痕实验、迁移实验和Matrigel侵袭实验证实,Flot-2表达上调后6-10B细胞的运动能力和侵袭能力均增强。裸鼠腹腔内接种后转移能力的比较分析结果进一步表明Flot-2表达上调后,6-10B细胞的转移能力明显增强。最后我们分析了Flot-2增强鼻咽癌细胞6-10B转移能力的可能原因,包括细胞表面微丝的增加、细胞骨架的重组、Cdc42基因表达的改变和伪足的形成等。本实验在前期工作的基础上,建立了稳定表达pcFlot-2的6-10B细胞系,成功的使Flot-2基因在6-10B细胞中表达上调;Flot-2基因表达上调后所引起的6-10B细胞一系列生物学特性的改变进一步证实Flot-2基因可作为鼻咽癌候选转移相关基因。
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- [1].脂筏标记蛋白flotillin-2生理功能的研究进展[J]. 中国兽医科学 2012(01)