脂肪酶产生菌分离与鉴定及其产酶条件优化和lip7基因克隆

论文摘要

脂肪酶是一类特殊的酯键水解酶,广泛存在于动物、植物和微生物中。近年来,脂肪酶已在食品加工、生物柴油制备、造纸、洗涤、医药等领域显示出了潜在的推广应用前景。但目前用于工业化生产的脂肪酶大多依靠进口,由于其价格昂贵,严重限制了它的推广使用。因此,有关脂肪酶的研发已成为当今研究的热点。本试验从油污土壤、油垢中分离产脂肪酶菌株,并对分离到的菌株进行分类地位鉴定;同时,对其发酵产酶条件及其酶学性质进行了研究。试验结果表明,筛选出了一株可产脂肪酶活力较高的菌株,命名为HDY-76;通过形态学观察和分子生物学鉴定,确定菌株HDY-76为解脂耶罗维亚酵母（Yarrowia lipolytica）。本试验确定的菌株HDY-76最佳发酵产酶条件为:蛋白陈20.0 g/L、蔗糖5.0 g/L、NH4Cl 0.5 g/L、MgSO4 0.3 g/L、NaCl 1.0 g/1L、Tween-80 0.4 mL/L（v/v）、转速 200±5r/min、pH3.0、培养温度 28℃、接种量 1.0%（v/v）、装液量 60mL/250mL、振荡培养50 h,脂肪酶产量由优化前（155.6±3.87）U/mL提高到（252.89±4.12）U/mL,提高了 62.53%。菌株HDY-76产脂肪酶的最适作用温度为45℃、最适作用pH为5.5;Mg2+对菌株HDY-76产的脂肪酶有激活作用,而Na+、Fe2+、EDTA、Cu2+、Mn2+对其有抑制作用;菌株HDY-76脂肪酶在pH4.0-6.0、温度30-50℃时有较好的稳定性。另外,本试验研究利用PCR技术成功克隆到了脂肪酶基因（lip7）,并在毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115中进行了表达,使酶活力提高到（329.43±6.52）U/mL,与优化后的酶活（252.89±4.12）U/mL相比提高了 30.27%。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第1章 前言
• 1.1 脂肪酶简介
• 1.1.1 微生物脂肪酶的分子结构及催化机制
• 1.1.2 脂肪酶的生产方法
• 1.1.3 脂肪酶活力的测定方法
• 1.2 产脂肪酶微生物及其筛选方法
• 1.2.1 产脂肪酶微生物
• 1.2.2 产脂肪酶微生物的筛选方法
• 1.3 提高脂肪酶产量及稳定性的方法
• 1.3.1 提高脂肪酶产量的方法
• 1.3.2 提高脂肪酶稳定性的方法
• 1.4 脂肪酶的分子生物学研究进展
• 1.5 脂肪酶的应用
• 1.5.1 在食品加工方面的应用
• 1.5.2 在手性化合物制备中的应用
• 1.5.3 在医药工业中的应用
• 1.5.4 在环境治理方面的应用
• 1.5.5 在生物柴油制备中的应用
• 1.6 本试验研究的目的和意义及主要内容
• 1.6.1 本试验研究的目的和意义
• 1.6.2 本试验研究主要内容
• 第2章 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 样品
• 2.1.2 菌株及质粒
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 主要生化与分子生物学试剂
• 2.1.5 主要仪器设备
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 产脂肪酶菌株的分离
• 2.2.2 脂肪酶产生菌的鉴定
• 2.2.3 脂肪酶产生菌发酵产酶条件的优化
• 2.2.4 脂肪酶产生菌脂肪酶酶学性质的研究
• 2.2.5 脂肪酶基因（lip 7）克隆及其在毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115中表达
• 第3章 结果与分析
• 3.1 产脂肪酶菌株的分离
• 3.1.1 初筛
• 3.1.2 复筛
• 3.2 脂肪酶产生菌株HDY-76的分类鉴定
• 3.2.1 形态学观察
• 3.2.2 分子生物学鉴定
• 3.3 菌株HDY-76发酵产酶条件的优化
• 3.3.1 菌株生长和产酶特征曲线
• 3.3.2 单因素试验
• 3.3.3 正交试验
• 3.4 菌株HDY-76脂肪酶酶学性质研究
• 3.4.1 pH对脂肪酶活性的影响
• 3.4.2 温度对脂肪酶活性的影响
• 3.4.3 金属离子对脂肪酶活性的影响
• 3.4.4 脂肪酶稳定性的研究
• 3.5 脂肪酶基因（lip7）的克隆与表达
• 3.5.1 脂肪酶基因（lip7）的克隆
• 3.5.2 毕赤酵母表达载体pGAPHαM- lip7构建
• 3.5.3 毕赤酵母（Pichia pastoris）的转化
• 第4章 讨论
• 4.1 脂肪酶产生菌的分离与鉴定
• 4.1.1 脂肪酶产生菌的分离
• 4.1.2 脂肪酶产生菌的鉴定
• 4.2 脂肪酶活力的测定
• 4.3 发酵培养基及培养条件对脂肪酶产量的影响
• 4.3.1 培养基成分对脂肪酶产量的影响
• 4.3.2 培养条件对脂肪酶产量的影响
• 4.4 脂肪酶基因的克隆与表达
• 第5章 结论
• 第6章 本论文的主要创新点
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表论文情况
• 攻读硕士学位期间参与研究课题情况