盘基网柄菌的固定化培养研究

论文摘要

盘基网柄菌（Dictyostelium discoideum）是群居生活的变形虫“阿米巴”（amoebae），属于真菌界粘菌亚界聚粘霉菌纲（Acrasiomzcetes），合成蛋白时具有与真核生物类似的翻译后修饰功能，因此可被应用于药用重组蛋白的异源表达。但是，盘基网柄菌在复杂培养基中的悬浮培养密度只能达到1-2×107mL-1，且生长十分缓慢，严重影响了盘基网柄菌表达系统的应用。本文从HL-5C培养基出发，考察了培养基pH、碳源、氮源及氨基酸对盘基网柄菌生长的影响。结果表明，细胞生长的最适pH为6．5；葡萄糖为菌体生长的最佳碳源，最适初始浓度为15g L；在培养基中添加氨基酸会延长盘基网柄菌的生长周期，但是少量添加色氨酸和半胱氨酸可以有效提高细胞密度。以棉织物纤维为固定化载体对盘基网柄菌的固定化培养方式进行了初步研究。研究表明，棉织物纤维适合作为固定化培养盘基网柄菌的载体。在摇瓶规模上，在25mL细胞培养液中加入0．4g载体，摇床转速140rpm，22℃培养，可获得最高的固定化细胞密度7．87×107mL-1。利用棉织物纤维直接固定化培养盘基网柄菌时，细胞生长十分缓慢，代时几乎延长了一倍。而采用两阶段固定化培养方法，即先将细胞悬浮培养至一定密度(1×107mL-1)，再加入载体进行固定化培养，在120h时可以获得最大固定化细胞密度1×108mL-1。在上述研究基础上，初步探讨了纤维床生物反应器在固定化培养盘基网柄菌中的应用。采用填塞PUF填料的旋转式纤维床反应器（RFB）培养时固定化效果较好，固定化细胞密度可达8．2×107mL-1。采用带有外循环的柱状纤维床反应器（FBB）培养时，在内径5cm、长16cm的FBB中装入由14×70cm的棉织物纤维和不锈钢丝网卷成的载体，先将细胞在普通5L发酵罐中悬浮培养至一定密度，再开启外循环进行固定化培养。发酵结束后测得固定化细胞密度达到1．37×108mL-1，为普通悬浮培养的4倍。在此培养工艺下shFasL的表达量可达到到173．7μgl-1，在此基础上进行的重复批次发酵实现了在360小时中shFasL的持续表达，细胞密度、蛋白产率均没有明显下降。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 目录
• 1 结论
• 1.1 盘基网柄菌概述
• 1.1.1 盘基网柄菌的生物学特征
• 1.1.2 盘基网柄菌的应用研究
• 1.2 盘基网柄菌表达系统
• 1.2.1 盘基网柄菌表达系统与各种通用表达系统的比较
• 1.2.2 盘基网柄菌表达异源蛋白研究进展
• 1.2.3 重组盘基网柄菌表达人可溶性Fas配体
• 1.3 盘基网柄菌的培养研究进展
• 1.3.1 盘基网柄菌的培养条件
• 1.3.2 盘基网柄菌的高密度培养策略
• 1.3.3 纤维床生物反应器研究进展
• 1.4 本文研究思路与内容
• 1.4.1 选题的目的及意义
• 1.4.2 研究计划
• 2 材料与方法
• 2.1 菌种与质粒
• 2.2 仪器与试剂
• 2.2.1 主要仪器
• 2.2.2 主要试剂
• 2.3 培养基及缓冲液
• 2.4 培养条件
• 2.4.1 菌种保藏
• 2.4.2 菌种活化
• 2.4.3 种子培养
• 2.4.4 悬浮培养
• 2.4.5 固定化培养
• 2.5 分析方法
• 2.5.1 细胞密度的测定
• 2.5.2 葡萄糖浓度的测定
• 2.5.3 重组可溶性人Fas配体（FasL）浓度的测定
• 3 盘基网柄菌的培养条件优化
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料与方法
• 3.2.1 菌种
• 3.2.2 培养基
• 3.2.3 培养条件
• 3.2.4 葡萄糖测定
• 3.2.5 细胞密度测定
• 3.2.6 pH的测定方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 盘基网柄菌在HL-5C培养基中的生长
• 3.3.2 培养基初始pH对盘基网柄菌生长的影响
• 3.3.3 碳源对盘基网柄菌生长的影响
• 3.3.4 氮源对盘基网柄菌生长的影响
• 3.3.5 盘基网柄菌的生长动力学研究
• 3.4 小结
• 4 棉织物纤维对盘基网柄菌的固定化性能研究
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料与方法
• 4.2.1 菌种
• 4.2.2 培养基
• 4.2.3 悬浮培养盘基网柄菌
• 4.2.4 固定化培养盘基网柄菌
• 4.2.5 悬浮及固定化细胞密度测定
• 4.2.6 扫描电镜样品制备方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 固定化细胞密度测定方法的确定
• 4.3.2 棉织物纤维的固定化性能研究
• 4.3.3 棉织物纤维的固定化条件研究
• 4.3.4 盘基网柄菌的固定化培养研究
• 4.3.5 盘基网柄菌在棉织物纤维载体上的固定化情况
• 4.4 小结
• 5 纤维床生物反应器固定化培养盘基网柄菌
• 5.1 引言
• 5.2 实验材料与方法
• 5.2.1 菌种
• 5.2.2 培养基
• 5.2.3 5L发酵罐中悬浮培养盘基网柄菌
• 5.2.4 FBB固定化培养培养盘基网柄菌
• 5.2.5 悬浮及固定化细胞密度测定
• 5.2.6 葡萄糖分析方法
• 5.2.7 pH的测定方法
• 5.2.8 重组可溶性人Fas配体（FasL）浓度的测定
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 盘基网柄菌的批式悬浮培养
• 5.3.2 旋转式纤维床生物反应器固定化培养盘基网柄菌
• 5.3.3 FBB固定化培养盘基网柄菌
• 5.3.4 利用FBB固定化盘基网柄菌表达重组shFasL
• 5.4 小结
• 6 结论与展望
• 参考文献